[发明专利]用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测微生物的引物。

背景技术

硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一类与硫酸盐还原反应相关的细菌的总称。由革兰氏阴性菌(如脱硫弧菌属Desulfovibrio，脱硫杆菌属Desulfobacterium)、革兰氏阳性菌(脱硫肠状菌属Desulfotomaculum)、嗜热细菌(热脱硫菌属Thermodesulfobacterium)和嗜热古细菌(古生球菌属Archaeoglobus)等多种微生物构成。

SRB菌通过一系列复杂的生物化学反应将硫酸盐还原成H₂S和大量的硫化物，硫化物和H₂S不仅腐蚀油田生产设备；而且其腐蚀产物(金属硫化物)不溶于水，导致污水发黑、悬浮固体含量增加，使处理后水中悬浮固体含量超标，严重的危害了油田的正常生产。因此，快速定量检测硫酸盐还原菌对于油田水质检测和地面系统杀菌剂浓度的合理调节具有重要的生产指导意义。但是，目前SRB菌的定量检测方法(如：绝迹稀释法等)存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前SRB菌的定量检测方法存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷，而提供的用于检测硫酸盐还原菌的引物。

用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列为5’-GTTCCCTGCTCGTGCCCT-3’；下游引物基因序列为5’-TTCCTTGAAGAAGATGTACGGGTT-3’。

用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’-AATGGTGGATGGAAGAAGGC-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。

异化型亚硫酸盐还原酶(dissimilatory sulfite reductase，DSR)是硫酸盐还原菌还原硫酸盐生成H₂S的关键酶。DSR基因在硫酸盐还原菌中具有保守性结构框架，DSR由三个不同的亚基组成的六聚体(α₂β₂γ₂)，异化型亚硫酸盐还原酶α亚基中包含有典型的硫酸盐-亚硝酸盐还原酶的保守框架(C-X₅-C)-X_n-(C-X₃-C)和CP-X_n-C-X₂-C-X₂-C框架能与[Fe₄S₄]-唏咯铁铁卟啉(siroheme)结合，是SRB菌共有的一个稳定靶位点；所以，本发明根据异化型亚硫酸盐还原酶基因序列的保守区域设计了具有特异性的引物和荧光探针。本发明引物和荧光探针特异性高，在引物和荧光探针的双重作用下假阳性大幅降低。使用本发明的引物和荧光探针进行荧光定量PCR检测硫酸盐还原菌，检测时间短、从样本的模板DNA提取到荧光定量PCR检测全过程仅需6h。

附图说明

图1是具体实施方式四中以pGEM-T-DSR为底物的PCR扩增曲线图，图1中曲线①模板浓度为2.31×10⁷copies/μL的PCR扩增曲线，②模板浓度为2.31×10⁶copies/μL的PCR扩增曲线，③模板浓度为2.31×10⁵copies/μL的PCR扩增曲线，④模板浓度为2.31×10⁴copies/μL的PCR扩增曲线，⑤模板浓度为2.31×10³copies/μL的PCR扩增曲线，⑥模板浓度为2.31×10²copies/μL的PCR扩增曲线，⑦模板浓度为0copies/μL的PCR扩增曲线；图2是具体实施方式四中硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列(FP)为5’-GTTCCCTGCTCGTGCCCT-3’；下游引物基因序列(RP)为5’-TTCCTTGAAGAAGATGTACGGGTT-3’。

本实施方式检测引物根据DSR基因在硫酸盐还原菌中具有的保守性结构框架而特异性设计、合成。