[发明专利]人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及一种外源性表达人端粒酶的骨髓间充质干细胞构建和筛选的新技术。这种技术能使骨髓间充质干细胞高效表达外源人端粒酶，由此提高骨髓间充质干细胞的生命周期。

背景技术

目前常用可用于延长细胞生命周期、使细胞永生化的技术大致可归为四种：Epstein-Barr病毒(EBV)感染技术，转猴病毒40(SV40)大T抗原技术，转16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7技术，转端粒酶基因技术。EB病毒与细胞共培养使细胞永生应用最多的是B淋巴细胞。EB病毒永生化B淋巴细胞的一个最显著特点就是端粒酶活性提高，这是导致B淋巴细胞永生的主要原因。SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合人靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。但是Shay等(1989)研究结果表明，在大多数情况下，SV40转染细胞的永生化率非常低。乳头瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV)可以使一些特殊细胞的增殖能力加强，但它们并不是使细胞永生的常用病毒。人乳头瘤病毒E6蛋白通过对端粒酶催化亚基(hTERT)的转录调控而激活端粒酶；hTERT启动子上游HBV增强子的整合可顺式激活hTERT基因转录，这种顺式激活作用是hTERT基因转录及端粒酶调节的原发机制。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体，为一种特殊的DNA聚合酶，合成DNA到染色体末端。端粒酶一旦被激活，将维持端粒缩短和延长的动态平衡，从而使细胞获得无限增殖的能力，使之永生。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活化可能是细胞永生化的共同步骤。延长细胞生命周期，使细胞永生化最常用的技术就是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体，通过各种方法来转染细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法，是通过转基因技术，对人骨髓间充质干细胞转导人端粒酶基因，提高人骨髓间充质干细胞中这种蛋白的表达水平，达到提高骨髓间充质干细胞的生命周期的目的。通过以下方案实现：

(1)构建pLXSN-hTERT表达载体，pGRN145质粒(Geron Corportion，Menlo Park，CA)采用Hpa I和Not I限制性内切酶(Takara)酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，并与采用相同限制性内切酶酶切的pLXSN载体(Stratagene，La Jolla，CA)相连，构建成pLXSN-hTERT重组表达载体。

本发明对pGRN 145质粒采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，第一步行hTERT cDNA片段提纯。

本发明对pLXSN载体(Stratagene，La Jolla，CA)采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到pLXSN载体片段，第二步行表达载体片段提纯。

本发明所用的人反转录病毒载体是采用pLXSN载体，获得高效表达hTERT的pLXSN-hTERT重组表达载体。

(2)构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞，依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317(ATCC，Rockefeller，MA)制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene，Sigma，St.Louis，MO)辅助下对人骨髓间充质干细胞(邱丽燕等，2004)进行8个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导。由此构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞。

(3)采用低浓度(20微克/毫升和50微克/毫升)潮霉素(Hygromycin)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)进行双重筛选转导外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的骨髓间充质干细胞的存活能力。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的技术中采用hTERT和pLXSN载体相接的高效表达hTERT的pLXSN-hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达hTERT外源性基因的人骨髓间充质干细胞的效果。