[发明专利]一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，更具体的是涉及一种通过化学修饰生产的热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，属于生物化学中蛋白质化学领域。

背景技术

目前，耐高温DNA聚合酶已广泛用于分子生物学中基因检测，基因克隆等技术领域，其主要功能是通过DNA聚合酶链式反应对待检测DNA进行信号放大。其基本原理类似于DNA的天然复制过程。DNA聚合酶链式反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至引物退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在耐高温DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。如此循环几十次后就能将待扩增的基因扩增放大几百万倍。在PCR反应中，热启动PCR是除了优化引物设计、PCR条件之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管耐高温DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，但该酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。目前实现PCR热启动方法包括：手工热启动方法、蜡防护层包裹法、抗体修饰法以及化学修饰法等几种。其中手工热启动方法由于操作烦琐，目前已较少人使用；蜡防护层包裹法由于工艺复杂以及热启动效果较差，不是一种理想的产业化方法；抗体法通过抗体特异性封闭酶活性中心，但该方法中的酶与抗体结合属于非化学键结合，在热启动酶保存过程中易出现抗体活性下降，热启动效果丧失的风险，同时抗体修饰法很难完全封闭酶的所有活性，因此也不是一种真正意义上最佳的封闭耐高温DNA聚合酶酶活的热启动修饰方法；化学修饰法通过化学物质与耐高温DNA聚合酶肽链上氨基形成稳定的酰氨键，在常温下可完全封闭酶的活性，通过高温将酰氨键水解，耐高温DNA聚合酶活性重新显示出来，因此该方法是目前生产热启动耐高温DNA聚合酶最理想的方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种热启动耐高温DNA聚合酶，该DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端的延伸活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度。这种热启动DNA聚合酶可广泛地应用于分子生物学中涉及到的各类DNA聚合酶链式反应，尤其适合于人类STR-PCR DNA复合扩增基因分型产品中。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述热启动耐高温DNA聚合酶的方法，即化学修饰法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

经化学修饰的热启动耐高温DNA聚合酶，其分子结构如下述通式(I)：

其中R₁，R₂，R₃各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔。

通过化学修饰制备热启动耐高温DNA聚合酶的方法，该方法包括以下步骤：

A：将通式为(II)的化学修饰物溶解于无水乙醇、二甲基亚砜、无水四氢呋喃或甲酰胺至溶液终浓度为0.1-10mol/L；将以上化学修饰物溶液按摩尔比2-100∶1加入pH为7.5-10的耐高温DNA聚合酶溶液中，0-45℃反应2-48小时；

其中，R为琥珀酸、磺酸基、单硝基、多硝基、单氟或多氟取代的苯酚；

R₁，R₂，R₃各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔。

B、将反应产物采用透析、过柱或超滤方法纯化，即得到热启动耐高温DNA聚合酶；

化学修饰法生产热启动耐高温DNA聚合酶反应原理如图1。