[发明专利]白喉毒素与GM－CSF突变体的融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是成人中发病率最高、儿童中发病率第二高的白血病，美国2006年预期新发病例为11,930例。目前用阿糖胞苷等化疗药物治疗AML的药效显著，完全缓解率可以达到70％。但是大多数患者长期用药产生耐药性，最终会死于复发或治疗综合征(complication of treatment)。复发和难治性AML患者的存活中数是几个星期或几个月，因此急需能够避免多药耐药表型的、具有独特治疗机制的新型药物。目前已知在88％AML患者的白血病细胞表面过量表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor，GM-CSF)高亲和力受体(GM-CSFReceptor，GM-CSFR)，而骨髓中的正常造血祖细胞，多能造血干细胞表面未发现有GM-CSFR(Hogge DE，WillmanCL，Kreitman RJ，Berger M，Hall PD，Kopecky KJ，McLain C，Tagge EP，EavesCJ，Frankel AE.Malignant progenitors from patients with acute myelogenousleukemia are sensitive to a Diphtheria Toxin-Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor fusion protein.Blood，1998，92(2)：589-595)。因此，GM-CSFR可能成为特异性治疗AML的药物靶标。

免疫毒素作为导向治疗药物，利用抗体、细胞因子等导向部分识别并结合特定的靶细胞表面，内吞进入细胞后，毒素效应部分发挥其细胞毒作用，从而特异性杀伤靶细胞。白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)是一种高效的生物毒素，全长535aa，分子量为58,330D，结构可分为3个彼此独立的结构域：N端1-193aa是酶活性区(Catalytic Domain，C区，DTA片段)，205-378aa是跨膜转运区(TransmembraneDomain，T区)，386-535aa是细胞膜受体结合区(Receptor Binding Domain，R区)。这3个结构域在一级结构上不交叉，三级结构上也彼此独立。在制备融合蛋白免疫毒素时，保存C和T区，R区用配体分子替换。由于白喉毒素类免疫毒素杀灭细胞的机制与传统治疗药物破坏DNA或细胞分裂的机制不同，是通过C区的ADP核糖基转移酶活性使真核细胞核糖体中的蛋白翻译延伸因子EF2失活，抑制细胞蛋白的翻译表达，并最终诱导靶细胞的凋亡，因此白喉毒素类免疫毒素对复发的、耐化疗药物的肿瘤细胞具有特异杀伤作用。目前唯一经美国FDA批准上市的免疫毒素即采用了截短的白喉毒素和IL2的融合蛋白(DAB₃₈₉-IL2)。因此，以GM-CSFR为靶向的导向药物将有效地特异性杀伤AML细胞，同时对机体的造血功能不造成严重损伤，从而有望为AML患者提供一种新型的、高特异性的治疗药物。目前虽然临床试验表明DT₃₈₈-GMCSF有10％的有效性，但是发现DT-GMCSF形式的免疫毒素有2个重要的缺点：首先，其在大肠杆菌中的表达量非常低，不利于大量生产(Williams MD，Rostovt sevA，Narla RK，Uckun FM.Production of recombinant DTct GMCSF fusion toxin ina baculovirus expression vector system for biotherapy of GMCSF-receptorpositive hematologic malignancies.Protein expr purif，1998，13：210-221)。虽然有人发现在杆状病毒表达系统中可以得到高表达，但是由于迄今为止尚无杆状病毒表达的蛋白药物得到FDA的批准，可能继续研制的阻力比较大。其次，在临床研究中发现具有肝毒性，可能是肝脏的枯比细胞具有GMCSF受体而造成的损伤，(Frankel AE，Powell BL，Hall PD，Case LD，Kreitman RJ.Phase I trial of anovel diphtheria toxin/granulocyte macrophage colony-stimulating factorfusion protein(DT388GMCSF)for refractory or relapsed acute myeloid leukemia.Clin Cancer Res，2002，8(5)：1004-13；Westcott MM，Abi-Habib RJ，Cohen KA，Willingham MC，Liu S，Bugge TH，Leppla SH，Frankel AE.Diphtheria toxin-murinegranulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced hepatotoxicity ismediated by Kupffer cells.Mol Cancer Ther.2004，3(12)：1681-9)故而仍需对蛋白进行改进，以降低体内的毒性。