[发明专利]巨细胞病毒特异性细胞免疫应答体外检测模型

说明书

技术领域

该发明涉及一种能在体外检测巨细胞病毒(CMV)特异性细胞免疫应答的模型，该模型不仅可以方便地在体外检测患者的巨细胞病毒特异性细胞免疫应答，而且可以筛选新型药物。

背景技术

近年来，科学家们纷纷致力于开发新的抗CMV药物，以期抑制病毒引起的免疫病理损伤。新药疗效的检测，首先需要建立一CMV特异性免疫应答体外检测模型，但目前国内外就此尚未见相关报道。将经典的CMV实验室株感染人成纤维母细胞为抗原递呈细胞，流式细胞仪检测细胞因子及HLA分子表达的方法，分析该病毒株感染的细胞诱导免疫应答的能力，研究发现感染细胞表面MHC I类分子表达明显降低，未能检测到病毒特异性的细胞免疫应答，因此并不适宜作为检测模型。

发明内容

为排除MHC I类分子表达降低而对抗原递呈的影响，本发明建立一种以CMV突变株感染人成纤维母细胞为抗原递呈细胞，刺激淋巴细胞，采用流式细胞仪检测细胞内IFN-γ表达的方法，建立一在体外检测CMV特异性细胞免疫应答的模型；该突变体基因组缺失了一段抑制主要组织相容性复合体I类分子表达的基因序列US11、US12，不影响MHC I类分子的表达，故不影响细胞对病毒特异性抗原的递呈。

具体实施方式：

一.CMV感染人成纤维母细胞刺激外周血淋巴细胞：将人成纤维母细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔加入2ml DMEM培养基，细胞长成单层，铺满全孔，按照1∶1的比例(数量比)，加入CMV突变株病毒液，37℃感染1小时，弃掉游离的病毒液，加入2ml DMEM细胞培养基，在37℃、5％CO₂的孵箱中孵育48小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，之后加入2×10⁶外周血淋巴细胞，孵育2小时后，加入10μg/ml高尔基体抑制剂Brefeldin A，继续培养4h。

二.细胞内细胞因子标记法检测IFN-γ：培养结束后，收集细胞，PBS洗涤一次，将细胞重悬于含0.02％EDTA的PBS溶液中，37℃孵育15分钟，离心，PBS洗涤一次，将细胞重悬于红细胞裂解液中室温避光孵育10分钟，洗涤、重悬细胞；加入破膜剂室温避光反应20分钟，PBS洗涤一次，加入鼠抗人CD8-APC、CD3-PerCP和IFN-γ-FITC抗体4℃避光标记30分钟，PBS洗涤一次后，重悬细胞，在流式细胞仪上进行检测，分析受到CMV感染细胞的刺激时，淋巴细胞产生IFN-γ作为CMV特异性免疫应答的指标。

本发明的有益效果是，能在体外检测患者的巨细胞病毒特异性的细胞免疫应答；若在该体系中加入待检的新药，即可检测其对细胞免疫应答的影响，从而筛选新药。