[发明专利]高粱成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术育种的方法，特别涉及一种高粱成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立的方法。

背景技术

对高粱组织进行培养及再生，其目的在于让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为高粱遗传转化和细胞工程研究创造有利条件。然而，高粱是目前公认的最难建立植物无性组织或器官再生体系和导入外源基因的作物之一。虽然高粱遗传化研究工作15年前就开始，但与其他具有重要经济价值的禾谷类作物如水稻、小麦、玉米等相比，由于高频再生和高效转化体系较难建立，因此其遗传转化研究工作发展较慢，成功的实例也较少。高粱与其他作物相比，通过组织培养获得再生植株相对更难一些。最早进行高粱组织培养研究的是Strogonol B.P.，1968年他利用高粱根和分蘖节在培养基上附加1mg/L 2，4-D、1mg/L KT、5mg/L泛酸钙、1mg/L抗坏血酸，诱导出愈伤组织，但是他并没有得到再生植株。此后，高粱组织培养研究工作得到一定重视。各国学者相继开展了高粱组织培养研究工作，所用的外植体主要有未成熟胚、成熟胚、幼穗、茎尖、种子、幼叶、花药、幼苗等。在成熟胚组织培养发面，虽然也有获得再生植株的相关报道，但是植株再生率均不高。1983年，国外首次报道了高粱成熟胚愈伤组织的诱导培养，同时进行了耐盐和耐铝筛选培养的研究，并获得了再生植株，但均未对培养基和培养条件做进一步介绍。1987年国外“Plant Cell，Tissue and OrganCulture”期刊中报道了以高粱成熟胚的芽端为外植体，在MS培养基上诱导出黄色、颗粒状的愈伤组织，并在MS培养基上分化出再生植株，再生率也仅为11％～48％。1995年外文期刊“India Journal of Agricultural Sciences”报道了高粱不同外植体的诱导培养研究，其中成熟胚培养的诱愈率也较低，而且也未对再生作进一步的介绍。国内以成熟胚为外植体的研究报道相对较少，国内几个刊物上对高粱成熟胚作为外植体有简单的报道，但愈伤诱导率、分化率都比较低。

发明内容

为实现上述目的本发明所采用的技术方案是：

一种高粱成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立的方法，其特征在于实施步骤如下：

(1)进行成熟胚愈伤组织诱导培养

将种子从颖壳中剥出，挑选无虫蚀、无裂痕、完整的、大小均匀一致的种子，在超净工作台上依次用75％酒精浸泡0.5-1min，5-20％次氯酸钠消毒20-50min、0.1％升汞消毒10-20min，再用无菌水冲洗4-5次，然后用无菌滤纸吸干种子表面的水分，晾干后接种于诱导培养基中；愈伤组织诱导基本培养基为MS，添加外源激素为2，4-D和KT；2，4-D的浓度为1.5-4.0mg/L，KT的浓度为0.0-2.0mg/L，并在诱导培养基中加入0-30mg/L的AgNO₃；pH为5.8-6.0；诱导条件为：光照8-12h，黑暗12-16h，温度22-30℃；

(2)进行愈伤组织继代培养

取诱导的初始淡黄色颗粒状愈伤组织接种在继代培养基中进行继代培养；继代培养基本培养基为MS，添加外源激素为2，4-D，2，4-D的浓度为1.0-4.0mg/L，pH为5.8-6.0；光照8-12h，黑暗12-16h，温度22-30℃；

(3)分化培养

将经过继代培养之后得到的块状、致密的愈伤组织在分化培养基中诱导胚状体的形成和幼苗分化；分化培养基基本培养基为MS，添加外源激素为IAA、6-BA和KT；IAA的浓度为0.5-4.0mg/L，6-BA的浓度为0.5-2.0mg/L，KT的浓度为0.5-2.0mg/L；培养条件为每日光强3000-4000Lx、光照10-16h，相对湿度为50-70％；

(4)生根培养

将从分化培养基分化出的再生植株长到5-8cm时移入生根培养基进行生根；生根培养基基本培养基为MS，添加外源激素为IAA、6-BA；IAA的浓度为1.0-4.0mg/L，6-BA的浓度为0.5-2.0mg/L；培养条件为每日光强3000-4000Lx、光照10-16h，相对湿度为50-70％；

(5)再生植株的移栽