[发明专利]铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL及应用

说明书

【技术领域】：本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因，即鞭毛运动相关基因fimL。

【背景技术】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一种分布广泛的条件致病菌，在临床上，它能引起菌血病、耳、眼、皮肤及软组织、骨及关节、心内膜和呼吸系统等的感染，是人类的三大致病菌之一，是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐药机制，耐药率高，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。

细菌生物被膜或称为菌膜，是细菌为适应不利的自然环境、维持自身生命而发生的形态学变化，形成一种有利于生存的特有的生命现象。当生物体内的细菌处于生长发育不利的环境时，菌体周边会分泌多糖复合物，使细菌相互粘连，附着于惰性物体如生物医学材料或粘膜表面并将其自身包绕在其中而形成的膜状物，使细菌可以停留在一个适宜的微环境中而不会被冲散。生物被膜的这种特殊结构可以作为一种屏障保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主免疫系统的清除，而成为潜在的感染源，导致难治性临床生物被膜的相关感染。鞭毛介导的泳动(swimming motility)和IV型菌毛介导的蹭动(twitching motility)都参与了生物被膜的早期形成。其中，蹭动是指细菌在固相表面上，依靠IV型菌毛的收缩和延伸，向周围运动的能力。

对生物被膜形成机制的研究，国内尚未见相关报道。由于生物被膜有非常重要的临床意义，最近几年，已引起国外一些科学家的重视，使他们涉足此领域进行研究。但其形成机制仍有许多未知领域等待探索。目前已知，生物被膜的形成大致分为三步：个体细胞的吸附；微菌落的形成；及成熟被膜的发育。我们对铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL的研究可以填补国内这一领域的空白，并完善铜绿假单胞菌生物被膜形成的机理。

【发明内容】：本发明目的是提供铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因、即鞭毛运动相关基因fimL，并用该基因为新药靶点研制抑制铜绿假单胞菌的新型药物。

本发明提供的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因长度为1689bp，位于铜绿假单胞菌基因组169节10946-10950。

上述的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL可以用于以该基因为新药靶点设计并制备抗菌药物；以及在食品卫生和耐药防治诸方面的应用。

本发明基因的获得方法：使用人工Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)，造成铜绿假单胞菌基因突变，建立突变子文库。筛选蹭动能力丧失的突变子，使用Bam HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5α，用卡那霉素和氨苄青霉素双抗LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷酸序列，发现Mu插入的基因，确定此基因与铜绿假单胞菌鞭毛运动有相关性。

本发明的有益效果：

实验发现本发明基因的缺失能够使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。

Mu插入失活的基因泳动能力丧失，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有关，这对鞭毛运动相关新基因的发现以及揭示新基因的功能都有指导意义。

通过本发明，可以针对fimL基因设计药物，限制其正常表达，使得细菌无法通过蹭行运动形成生物被膜，降低其耐药性，达到治疗铜绿假单胞菌引起的感染的目的。

【附图说明】：

图1是蹭动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图，

1、野生型PA68作为阳性对照  2、fimL::Mu PA6g突变株

图2是Mu克隆子酶切产物电泳图，1、DL15000 2、质粒3、质粒酶切

图3是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)，

4、DL2000  5、Mu克隆子PCR产物。

用Mu-kam P1和Mu-kam P2作为引物，克隆子质粒DNA为模板，可以扩增出700bp的特异性片段，说明所检测的克隆子质粒中携带着插入了Mu转座子的基因片段。

【具体实施方式】：

实施例1：使用Mu转座技术进行突变子文库的建立

(1)将临床分离株铜绿假单胞菌PA68接种于50ml L-broth培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/LNaCl)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

(2)次日按1∶100接种至200ml L-broth培养基中，200rpm，37℃培养至OD₅₄₀≈0.5，终止培养。