[发明专利]一种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法无效
申请号: | 200710059345.4 | 申请日: | 2007-08-29 |
公开(公告)号: | CN101144059A | 公开(公告)日: | 2008-03-19 |
发明(设计)人: | 宋东辉;施定基;宋海燕;时文才;张琪 | 申请(专利权)人: | 天津科技大学 |
主分类号: | C12N1/12 | 分类号: | C12N1/12 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 300222天*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 共生 蓝藻 分离 纯化 培养 优化 方法 | ||
技术领域
本发明涉及生物共生体的分离,具体地说是一种共生蓝藻的分离纯化以及培养优化的方法,适用于生物科学和生物技术领域中共生体的体外营养和离体培养条件的建立,有利于共生生物体内活性代谢物质的应用研究。
背景技术
共生生物与宿主之间是一种互相依存、互惠互利的协作关系,共生体代谢产生的活性物质在医疗、卫生保健以及现代生物制药中发挥越来越大的作用。作为一种内共生,单独研究共生生物在宿主体内的代谢和共生生物的生理和生化特性就显得尤其重要,但分离纯化共生生物并在体外建立培养模式非常困难。特别是共生蓝藻的分离纯化以及离体培养是进一步研究共生体的基础条件和关键环节。由于共生蓝藻特殊的营养需求难以建立体外培养模式,绝大多数共生蓝藻很难离体培养成功。
共生蓝藻的分离方法通常采用生物化学法以及物理或机械法。适用于实验室内小规模分离蓝藻共生体的生物化学法主要是酶解法,物理或机械法有挤压法、滚筒压榨法、抽吸法和匀浆法。酶解法利用不同的酶反应,分解破坏共生蓝藻与宿主细胞之间的特殊键,从而达到分离的目的。酶解法价格高,通用性差,需选择不同的酶,易引起所需蛋白质或活性物质变性。物理或机械法中的滚筒压榨法通常将共生体放在滚筒中间高速离心,在离心旋转力的作用下抛离共生蓝藻。该法易使共生蓝藻物理性状发生变化,后期培养的成功率较低。抽吸法主要通过负压接受器对共生蓝藻进行脉冲式负压抽吸达到分离目的,也会使共生蓝藻物理性状发生变化。匀浆法通过固体剪切力破碎共生体组织细胞,释放共生蓝藻进入提取液。由于匀浆过程中冲击力较小使共生蓝藻物理性状被破坏的可能性较小,所以匀浆法是实验室中简便、快速、风险小的组织破碎分离方法。
共生蓝藻长期适应宿主体液环境,体外培养要求较高,难度较大。离体的共生蓝藻需要在体外尽快建立与体内一致的营养关系,以形成完善的营养代谢机制,进行正常的生理生化反应。特别是具有固氮能力的共生蓝藻,需要在无氮源环境下才能正常生长,何时添加氮源对其生长影响很大。因此选择合适的培养基对共生蓝藻的体外培养尤其关键。目前大多数共生蓝藻很难离体培养成功的主要原因,在于不能及时建立体外培养所需的营养代谢模式。
发明内容
本发明的目的是针对共生蓝藻分离纯化及体外培养技术的不足,提供一种共生蓝藻分离纯化及培养优化的方法,为进一步研究共生蓝藻的本质以及共生体活性代谢物质的应用打下基础。
为实现这一目的,本发明将玻璃匀浆器分离的共生体组织,在含无机氮的BG-11(+N)培养液中建立初步的体外营养代谢关系,再更换无氮的BG-11(-N)培养液完善其自身固氮的培养代谢机制,并改善光照强度和pH值条件,优化共生蓝藻的体外培养模式。本发明可快速建立共生蓝藻体外营养模式,缩短分离纯化共生蓝藻的时间,降低成本,提高分离纯化共生蓝藻的成功率,能得到非常纯净的共生蓝藻,使离体培养的共生蓝藻与内共生蓝藻的物理性状保持一致。
本发明采用的技术方案为:
1.共生蓝藻分离纯化步骤如下:共生体经表面消毒、浸泡、无菌水清洗、玻璃匀浆器研磨、滤液离心,沉淀经含无机氮的BG-11(+N)培养液重悬后在光照培养箱中培养。BG-11(+N)培养液培养14天后换无氮的BG-11(-N)培养液继续培养,并在BG-11(-N)固体培养基平板上划线分离,20天后单藻落出现,连续重复划板3次,直至纯化。
2.共生蓝藻培养优化步骤如下:采用无氮的BG-11(-N)液体培养基和优化条件振荡培养共生蓝藻,每15天更换新鲜无氮BG-11(-N)液体培养基。优化培养条件为温度25℃,光照强度160μmol·m-2·s-1,pH8.4,光照周期18h/6h,湿度90%,转速100rpm。
3.所述共生蓝藻包括石耳科黑石耳、红石耳、绒毛石耳以及黄山石耳等地衣共生体中的固氮丝状体蓝藻。
附图说明
图1为本发明实施例中浸水后野生黄山石耳内生蓝藻的显微照片(20×10)。共生状态的蓝藻细胞呈念珠状排列。具有固氮功能的异形胞位于链中部或末端,体型较营养细胞大。
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