[发明专利]HCMVPP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于特别涉及一种HCMVPP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒。

背景技术

国外巨细胞感染检测相关技术的研究与开发现状：尽管病毒壳脱落离心培养技术得到了极其广泛的应用，但其耗时较长，结果受标本保存时间影响大，所以其临床应用价值尚不明朗。血清学试验由于只能在感染2～4W后才能检出阳性结果，而且受器官移植后免疫抑制剂的影响，不能分辩潜伏性感染和活动性感染，其临床应用价值受到一定的限制。近来，国外报道了标准化的HCMV分析法有助于预测HCMV病。抗原血症检测技术是一种更快速、更敏感、早期检测CMV活动性感染的技术，pp65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病.在出现临床症状以前，抗原血症检测技术和PCR技术均可检测和鉴定出CMV的感染。目前HCMV pp65抗原血症检测试剂盒在国外已有两家公司商品化，并在美国FDA注册。在我国已有此方面的诊断技术引入，但均为进口试剂。

国内巨细胞感染检测相关技术的研究与开发现状：目前，国内对器官移植患者的感染合并症，虽然临床上经常遇到，但实际认识水平大都不高，研究也不多，诊断手段还不全，广泛使用的还是血清学诊断方法，不能够达到早期诊断地目的。在国内采用的同类产品全部是进口试剂，而至今在我国尚未有开发上市的国产试剂，虽有应用方面的相关研究，但国内未见研制和生产方面的研究。

我们目前的研究表明，一旦出现CMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进程，这意味着抗病毒药物必须在CMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的分析来预测CMV病。本研究前瞻性地研究了白细胞中CMV阳性细胞数量与CMV临床症状之间的关系，证实CMV阳性细胞数量可以预测CMV临床症状，其峰值要比CMV感染临床症状出现早1~2个月。因此我们认为使用HCMVpp65抗原血症间接免疫荧光法检测白细胞中CMV阳性细胞数量是一个简单、快速而敏感的预测CMV感染的方法。原有的HCMVP65抗原血症间接免疫荧光法检测试，制作方法落后，过程复杂，中间过程控制较难，结果不理想。特异性与敏感性低。

从巨细胞pp65单克隆抗体制备的角度，研究了白细胞中CMV阳性细胞数量与CMV临床症状之间的关系。通过新型抗体组的开发，提高试剂的敏感度，增加阳性样本细胞的着色数量。此理论基础已从临床应用中获得验证，阳性样本的染色细胞数量明显高于国外试剂。弥补无同类国产试剂空白，临床评估证明产品性能已达国际水平。应用pp65抗原血症检指导抗病毒药物的使用进行早期性预排空治疗，对提高器官移植存活率意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种HCMVP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂。方法先进，步骤简化，结果理想。

本发明的技术方案：

采用的关键技术为(1)人巨细胞病毒1A6与4A8单克隆抗体制备与鉴定。(2)直接裂解红细胞技术。

(1)巨细胞病毒(CMV)pp65蛋白的单克隆抗体制备基本过程与鉴定

pp65蛋白的单克隆抗体其制作方法为：以巨细胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合，通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化，获得鼠抗巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过ELISA和免疫荧光实验等方法鉴定其特性；

成功地建立了2株稳定分泌pp65蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A6，和4A8；通过ELISA，免疫荧光实验等方法的鉴定，抗pp65蛋白的单克隆抗体性能与pp65蛋白发生特异性反应；免疫荧光实验的结果表明，pp65蛋白的单克隆抗体性能与以巨细胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白发生特异性结合；结果显示，C10/C11单克隆抗体--阳性对照抗体，与待筛选单克隆抗体作用的巨细胞病毒感染的人胚成纤维细胞株细胞的胞核均出现明显的pp65蛋白荧光反应，与小鼠IgG作用不发生反应；由此获得了特异性识别抗巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体，为人巨细胞病毒病毒pp65蛋白抗原血症检测试剂的研制奠定了基础；

所需材料与方法

A动物

6～8周的Balb/C小鼠，雌性，北京大学医学部实验动物科学部提供[SCXK(京)2004-002]。

1.2试剂