[发明专利]人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化

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技术领域

本发明属于生物技术领域。

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1、心肌组织脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein；H-FABP)

(1).FABP的性质和特征

脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid Binding Protein；FABP)首先由Ockner等在1972年研究大鼠的小肠脂肪酸吸收的调节时，在肠粘膜发现的一族同源性的小分子细胞内蛋白质^[1]。分子量为12-16KD，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中^[2]。已发现的FABPs包括心肌型(H-FABP)、小肠型(I-FABP)、肝脏型(L-FABP)、脂肪细胞型(A-FABP)、脑细胞型(B-FABP)、肾脏型(K-FABP)、骨骼肌型(s-FABP)、牛皮癣相关型(PA-FABP)及表皮型(E-FABP)9种类型^[1-6]。FABPs以其在组织中的分布而命名，在同一细胞中可分布多种FABPs，例如在小肠内皮细胞上存在两种不同FABPs，即L-FABP和I-FABP，二者具有29％的同源性。不同型FABP的序列有较大的同源性^[3]。其中H-FABP是一种可溶性细胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为14-15KD^[5]，其中还有多个苏氨酸和赖氨酸，缺少半胱氨酸，在其N末端有一个乙酰化的缬氨酸残基。H-FABP是一种酸性蛋白质，其等电点(pl)为5.1。它特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4-8％。1它在心脏及某些骨骼肌中含量丰富，心脏和骨骼肌中含有相同类型的H-FABP，但是在心肌中它的含量比骨骼肌中要高几倍。每克湿重心肌含H-FABP约0.5mg。而每克湿重骨骼肌含H-FABP仅0.14m^[7]。H-FABP在心肌组织中含量(0.5mg/g)比肌红蛋白(2.5mg/g)小5倍，但H-FABP在血浆中的参考浓度(2μg/L)比肌红蛋白(32μg/L)大约低15倍^[8]。

从人心肌中纯化的H-FABP，已制备出单克隆抗体，建立了非竞争夹心ELISA法测定组织和血浆中的H-FABP浓度。Glatz等^[8]报告健康人血浆H-FABP水平为：(2.1±1.1)μg/L，上限(鉴别值)为5μg/L。

H-FABP是新推荐的AMI的血浆生化标志物，其血浆动力学同肌红蛋白相似。AMI后3小时内发现其血浆浓度升高，通常12～24小时内返回到正常，这就使得H-FABP对早期评价或排除AMI成为一个有用的生化标志物。Glatz等^[9]报告83例AMI患者，在住院期间作了一系列检查，结果显示：对AMI的诊断灵敏度，H-FABP为78％，MYO为53％，CK-MB为57％。此外，MYO和CK-MB活性增加的患者，99％也表现有H-FABP浓度增加。H-FABP还可以用作判断围手术期心肌损伤的指标。Suzuki等^[10]发现H-FABP在心肌再灌注后60分钟内立即出现高峰，远在CK-MB和cTnT之前。因此，作为AMI早期诊断的一种更好的生化指标，H-FABP具有更大的潜能。H-FABP正成为心血管疾病诊断的有效标志物^{[4]-3，.[11](13)]}。

FABPs能够与疏水性配体分子如长链脂肪酸(FA)、维生素(视黄醇)、视黄酸、某些有机阴离子等发生特异性结合，是关键的脂肪酸载体蛋白。它可将FA从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒的能量代谢体系之中，使FA在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为肌肉收缩提供能量^[20]。由于各型FABP具有各自特异的抗原决定簇，可以通过免疫学方法将H-FABP与其它型的FABP相区别，所以，随着FABP测定方法的研究和临床应用，FABP成为很多疾病诊断的有效标志物。