[发明专利]一种植物根表生防细菌的快速、高效筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生产技术领域。是一种为拮抗植物病原真菌的植物根表生防细菌快速、高效筛选方法。

背景技术

全国各地每年都会因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黄化等不同症状，严重时全株死亡，造成巨大的经济损失，其中有80％病害属于真菌病害。在防治方面，化学防治虽然见效快，但易造成农药残留、环境污染，对人们身体健康产生潜在的威胁；同时化学农药的长期使用，病原菌也易对其产生抗药性因而导致防治效果下降。细菌存在范围广，种类多，数量大，繁殖快，它们中有的能产生拮抗性物质，抑制病原菌，并且促进植物的生长，所以利用细菌防治植物病害，尤其是土传病害，具有很大的潜力。随着人们生活水平的提高，对食品安全性要求也在不断地提高，筛选出可替代化学药剂防治植物病害的生防制剂成为迫切需要。

国内外很多学者研究证明，有许多种拮抗性细菌具有防治植物病害尤其是土传病害的能力，常见的有以下一些属：芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobaeter)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flazobacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)、小单孢菌属(Micromonspora)、假单胞菌属(Pseu.domonas)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属(Streptomyces)和黄单胞菌属(Xanthomonas)。有的生防细菌不仅具有防病作用，同时还可以提高种子的发芽率，还有明显的增产效应。

目前，生防细菌的筛选普遍采用的步骤是，首先将植物组织研磨采用稀释涂布平板法分离组织内能培养的绝大多数细菌，取单个菌落在平板上不断划线纯化后，与病原真菌平板对峙培养进行筛选。如果从土壤中分离，则先稀释土壤悬浮液采用稀释涂布平板法或稀释混合平板法分离土壤中适合该培养基的所有细菌，纯化后进行平板一一对峙培养或点接法培养进行筛选。工作量较大，重复工作较多，试验过程中需要的培养基和培养皿量大，筛选到有生防效果的细菌概率较小，即耗时耗材。

发明内容

本发明的目的是高效筛选防治植物真菌病害尤其是土传病害的植物根表生防细菌，以达到缩短生防细菌的筛选阶段，加快生防细菌的开发和应用，使农业生产实践中植物病害得到很好的控制。本发明的关键技术是对已有的传统分离、筛选方法，进行了改进，采用改进的TY培养基，稀释平板法分离细菌，在另一Ch+TY平板上均匀地涂上病原真菌悬浮液，然后接种菌落形状、大小和颜色不同的10个细菌菌落进行培养，观察真菌周围是否有抑菌带出现，有抑菌带出现的即为目标细菌。改目前的先稀释平板法分离然后多次重复一一对峙培养筛选为病原真菌与植物根表细菌直接对峙培养法筛选，使生防细菌对病原真菌的拮抗能力明显增强，并且时间短，根表生防细菌的筛选可缩短30d左右。该方法耗材少，工作量小，仅用传统方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，筛选到的细菌田间应用防治效果明显提高。

具体方法如下：

1.细菌分离和初筛

Ch+TY培养基的配制(适合多数真菌和细菌生长)：

Nutrient agar            4g

Yeast Extract            0.2g

Bacto-Agar               2g

Lactalbumin hydrolysate  0.1g

Distilled H₂O            200ml

高压灭菌                 15min

步骤：

1)用酒精将剪子和镊子表面消毒；

2)剪3cm左右的不同植物干根；

3)在无菌室将剪下的不同植物干根置于Ch+TY平板上；

4)然后挑取病原真菌，在植物根平行的位置划线；

5)于25℃真菌培养箱中培养3天左右观察抑菌情况。

2.纯化

发现植物根周围有大量细菌，细菌周围出现抑菌带(不长真菌)或菌丝长得较短、产生较少孢子或没有孢子产生，即为目标细菌。但此时细菌为混合菌，需小心挑出，划线纯化，于28℃细菌培养箱中培养。一天即可观察，如果发现仍有形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则需分别挑取进一步纯化，直至每皿呈现形状、大小和颜色均相同菌落。

3.复筛方法