[发明专利]人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法

权利要求书

1、人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其包括如下步骤：

(1).将鲜参切成小块，按1～3ml/g的比例加入含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液匀浆，浸提后合并所得上清液，即为人参总蛋白粗提液；

(2).向上述人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠或磷酸钠至70～90％饱和度，混匀后于1～10℃静置12～36小时，再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取沉淀；然后按1～3ml/g的比例将沉淀溶于pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液后装入透析袋中，透析袋截留分子量为6000～8000Da，1～10℃透析12～36小时，透析保留液于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液冷冻干燥后即为人参总蛋白样品；

(3).将人参总蛋白样品上样于截流分子质量为10kDa的超滤仪进行超滤，分别收集大、小分子流出液，冷冻干燥后得到分子质量大于10kDa的大分子样品A1和分子质量小于10kDa的小分子样品A2；

(4).将样品A1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液透析、透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤缓冲液平衡好的Affi-gel(bluegel)亲和层析柱，洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含1～2mol/L NaCl的此步骤缓冲液进行盐阶段洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，分别收集得到未吸附样品A1B1和盐阶段洗脱样品A1B2；

(5).将盐洗脱样品A1B2用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-Sepharose FF离子交换柱，洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集第二个洗脱峰A1B2C2，得人参蛋白GP1，其分子量范围在23～27kDa；

(6).将样品A1 B1用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-SepharoseFF离子交换柱，用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集未吸附样品A1B1C1，收集第一个洗脱峰A1B1C2，得人参蛋白GP2，其分子量范围在60～70kDa，并收集第二个洗脱峰A1B1C3；

(7).将样品A1B1C1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3ml/min，得到第一个洗脱峰A1B1C1D1，为人参蛋白GP3，其分子量范围在10～20kDa；

(8).将样品A1B1C3用含1～2mol/L硫酸铵的pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析柱，用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，得到未吸附部分A1B1C3D1，为人参蛋白GP4，其分子量范围在60～70kDa；

(9).将样品A2上样于用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，用此缓冲液洗脱至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，得到第一个洗脱峰A2B1，为人参蛋白GP5，其分子量范围在5～10kDa；

(10).收集上述各步骤获得的人参蛋白样品GP1～GP5，分别经过pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液1～10℃透析12～36h，透析袋截留分子量范围为6000～8000Da，透析保留液再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液冷冻干燥后即得人参水溶性蛋白。