[发明专利]富精氨酸多肽－金纳米粒子细胞传输载体合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法。

技术背景

无机纳米生物传输系统因其超小体积、特异的性质(如荧光、磁性、致密性)为活细胞内生化过程的获得及医用靶向药物治疗提供了新的媒介和技术手段(自然生物技术，Nat.Biotechnol.2001，19，1013-1017)。其中生物分子和金纳米的杂交粒子又以其生物相容性、独特的光学性质可以对细胞进行实时、动态的观测，因此已有一些研究将DNA，蛋白、抗体、多聚物分子与金粒子相连接来实现跨细胞膜传输(科学，Science，2006，312，1027-1030；生物聚合体化学，Bioconjugate Chen.2004，15，482-490)。近几年多肽分子也被应用于功能化金纳米粒子，该方法可以使金纳米粒子在水溶液中保持高稳定性(美国化学会志，J.Am.Chem.Soc.2004，126，10076-10084)，并实现高效率的跨膜传输(美国国家科学院院刊，Proc.Natl.Acad.Sc.U.S.A.2006，103，1215-1220)。其中，多种从病毒跨膜蛋白提取的富精氨酸多肽不仅能够自动高效的跨膜，并且可将外源大分子传递进入细胞核(生物化学杂志，J.Biol.Chem.2001，276，5836-5840；生物聚合体化学，Bioconjugate Chem.2004，15，475-481)。然而，现有的利用肽链作为传递介质的金纳米载体的合成方法往往需要使用高聚物或蛋白来稳定金纳米粒子，再结合传递肽链，合成过程往往非常复杂，需要较长的反应时间，并且难以结合多种分子，实现多功能化。(美国化学会志，J.Am.Chem.Soc.2004，126，10076-10084；生物聚合体化学，Bioconjugate Chem.2005，16，1176-1180)

发明内容

本发明的目的是提供富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体的合成方法。

多肽CALNN与金表面有很强的亲和性，能够形成致密的保护层，使金纳米粒子溶于水溶液，并可以保持长期的稳定性。CALNN肽链N端的半胱氨酸能够以硫醇键与金表面形成牢固的共价键，疏水性的丙氨酸和亮氨酸能够促进多肽的自组装，在C端的两个天冬酰氨使多肽亲水。富精氨酸多肽(CALNNR₈)能够高效穿透细胞膜，并有针对性的聚集在细胞内特定位置。本发明结合这两种多肽的优势，优化合成条件，建立了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体的合成方法。

实现本发明的方法的具体的技术方案如下：

提供了一种富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法。

首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸，制备出粒径为30nm金纳米粒子；

使氨基酸序列为CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNR₈)的多肽混合，使两种多肽的摩尔浓度比例分别为90％∶10％或0％∶100％，得到多肽混合物；将该多肽混合物加入到粒径为30nm金纳米溶液中，使多肽的摩尔总浓度为1-1.5mM，在室温下静置反应1h，将溶液的pH值调节至3-6，使金纳米粒子在溶液中保持单分散，离心10000rpm后抛弃上清液，然后加入与上清液等量的pH值为3-6的去离子水，最后合成出了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体。

将培养好的细胞离心1000rpm，5min富集，用0.1M磷酸缓冲溶液(PBS)清洗，离心1000rpm，5min富集，去除上清液，将1ml，0.32nM多肽-金纳米粒子溶液与1×10⁴个细胞混合均匀反应2h，加入与金纳米溶液等量pH值相同的培养基，在5％CO₂，37℃环境下培养24小时。通过光学显微镜及暗场显微镜观察，共培养12小时后金纳米粒子集中在细胞的特定位置，该位置呈现红色，24小时后由于大量粒子的聚集，靶标位置呈现红黑色，细胞其它部位呈现淡红色。

本发明的有益效果明显：

(1)、本发明应用多肽表面修饰法：使用一种多肽稳定包裹金纳米粒子，第二种多肽实现纳米粒子的细胞跨膜传输功能。调节反应初始混合物中稳定多肽与传输多肽的比例，能获得不同传输能力的富精氨酸多肽多肽-金纳米载体。