[发明专利]一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法。

背景技术

目前，在国际国内关于玉米遗传转化技术的方法主要有：基因枪介导法、根癌农杆菌介导法、PEG介导法、花粉管通道法、子房注射法、超声波法、阳离子转化法等。基因枪介导法和根癌农杆菌介导法为最常规方法广泛采用。其不足是：基因枪介导法不仅价格比较高，而且在基因整合的过程中经常发生重排和高拷贝插入现象，外源基因在后代的遗传稳定性较差，很难筛选出抗性较强的品系，且容易导致外源基因的失活；根癌农杆菌介导法外源基因插入的完整性好，但转化率极低，外源基因表达易失活，筛选转化体较难，必须使用标记基因Npt II、Hpt和Bar等，工作量大，同时，愈伤组织的高频分化以及再生植株的移栽成活率低依然是困扰人们的难题。

本发明采用发根农杆菌(Ri)介导法遗传转化玉米较比根癌农杆菌(Ti)介导的遗传转化的优点体现在：(i)Ri质粒可以不经“解除武装(disarm)”进行转化，并且转化产生的毛状根能够再生植株；(ii)毛状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体，并且毛状根每一个细胞都是通过转化而来的有利于遗传操作；(iii)可直接作为中间载体；(iv)Ri质粒和Ti质粒可以配合使用，建立双元载体。拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；(v)毛状根适于进行离体培养，而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植株所有的特征；(vi)产生的再生植株产生稳定的可遗传的变异，在利用Ti质粒转化时，由于T-DNA插入植物基因组是随机的，因而可能产生具有不同基因型的重组细胞。而毛状根是单细胞起源的，这就为目标克隆的筛选以及新的有益变异的发现提供了方便。对于抗性育种具有十分重要的意义。同时，由于毛状根在培养过程中高频分化，极易再生植株。又由于获得的再生植株根系发达移栽成活率高，因此更具有实用性和可操作性。

发明内容

本发明的目的是建立一种高效、稳定、简便的利用发根农杆菌介导玉米遗传转化方法。通过外源基因和Ri质粒rol基因的表达，实现转基因植株基因转移和抗旱的双重目的。解决玉米转基因工程育种中已有技术存在的外源基因转化率低、筛选转化体难、后代遗传稳定性差、易失活、移栽成活率低等关键技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

发根农杆菌侵染玉米愈伤组织诱导产生毛状根，毛状根经分化培养再生转基因植株；以Ri质粒为载体，将一个或多个外源基因导入受体基因组中。所使用的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌系为：ATCC15834或Ri1000或Ri1601或A₄，来源于法国园艺研究中心。

本发明方法包括以下具体步骤：

Ri质粒的转化载体构建，将外源基因导入T-DNA，中间载体采用pBI121，并带有nos-pro，nos-ter(T-DNA限制性内切酶片断)及npt-II基因；把外源基因插入T-DNA的35S启动子和终止子之间构建中间载体；将中间载体导入发根农杆菌，通过诱导菌株的协助质粒E.coli HB101(pRK2013)、携带中间载体pBI121-外源基因的大肠杆菌和发根农杆菌直接进行三亲杂交，再通过同源重组把中间载体整合到Ri质粒的T-DNA中。通过酶切和测序进行检测(参考文献如王关林，方宏筠主编.植物基因工程.北京：科学出版社，2002.SHI Bu-Jun等1997J.Gen.Virology：1181～1185)。将携带有中间载体pBI121的发根农杆菌振荡培养当A₆₀₀为1.2时用于侵染玉米愈伤组织诱导毛状根，将产生的毛状根分化培养再生植株。

具体操作如下：

1、将pBI121质粒导入发根农杆菌：

a、质粒pBI121的制备：

试剂：STE(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH 8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后4℃储存)；溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)；溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS(新鲜配制)；溶液III(5mol/L KAc 60mi)冰乙酸11.5ml，dH₂O 28.5ml(pH4.8))。