[发明专利]用表面等离子体子共振传感器研究药物与生物分子相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明属于用波长检测型表面等离子体子共振(Surface plasmon resonance，SPR)传感器研究药物与生物分子相互作用的方法领域，特别涉及本课题组研制的波长检测型SPR分析仪及其应用方法。

背景技术

自从Liedberg等将SPR技术用于化学和生物传感器研究领域以来，SPR传感器逐渐成为国际传感器领域的研究热点。近年来在分子水平上进行功能研究的技术大量涌现，其中SPR技术比较引人注目。尤其自上世纪九十年代Pharmacia公司(现为BIAcore AB公司)将这一技术商品化以来，SPR技术用于生物分子相互作用的研究取得了迅猛的发展。短短几年内，运用此新技术所发表的文献几乎包括了现代生物医学的各个领域，使分子相互作用的研究取得了前所未有的突破，进而全面推动了生命科学研究的各个领域的进展。由于SPR技术具有能实时监测反应动态过程、样品无需标记、灵敏度较高、无背景干扰等特点，主要应用于研究大分子之间的相互作用，可得到反应物分子之间每一步的键合信息，测定动力学常数，已在生物科学领域应用中取得了长足进展。据粗略的统计，在生物传感器领域发表的文章中，大约有70％报道了关于SPR传感器被应用到对生物分子间反应的检测。

已报道的各类SPR商品仪器都是采用固定波长，测定共振角度变化的工作模式，这种工作模式，或者需要有一个机械传动装置来改变入射光角度，或者需要通过点光源的发散作用，测定角度的变化。前者在仪器中有一个可动部件，后者测量的角度范围较小，限制了方法的应用。这类市售的棱镜型SPR传感器仪器价格昂贵，不宜普及。自行设计组装的波长检测型SPR分析仪容易实现多波长同时检测，且检测的波长范围不受限制，这样不仅使传感器表面被检测物质量的范围不受限制，即折射率变化的范围不受限制，而且非常有益于分子间或分子与组织(如细胞)间相互作用的研究；其次，由于现在用于波长选择的器件比较成熟，且有的器件具有很高的波长分辨能力，所以有望进一步提高SPR分析仪的灵敏度。本仪器特别适于分子间相互作用的研究，对于研究药物与生物分子的作用、药物筛选及药物化学的发展具有重要意义，且对SPR传感器方法、仪器装置的发展及应用也具有重要意义。

传统的药物与蛋白质结合的研究方法有：平衡透析法和超滤法。其中平衡透析法为经典的参比方法，由于需建立结合平衡，运用此法耗时长(几个小时或几天)。超滤法则由于常需进行放射性或荧光标记而带来很大不便。这两种方法均存在膜对药物的吸附，以及Donnan效应(由于蛋白和药物均带电荷，使得膜两侧的游离药物浓度不相等)等问题，对于高结合率药物的游离药物浓度难以准确检测。其他方法还有免疫分析法，液相色谱法，荧光淬灭法和毛细管电泳法。其中免疫分析法耗时长，而且只能用于定性、半定量，无法满足深层次药物与蛋白质结合研究的要求；液相色谱法不仅需要样品量大、柱吸附严重，且常需添加改良溶剂，不能准确评价生理条件下的药物与蛋白质结合作用；当药物与白蛋白结合的位点远离色氨酸时，此时应用荧光淬灭法就不能检测到药物与蛋白的结合；毛细管电泳法最主要的缺点是它的灵敏度不高。

近年来，SPR已经广泛应用于药物-蛋白的结合研究。将一系列药物作用在已固定的蛋白上，根据药物与蛋白作用的SPR信号强度来确定药物与蛋白的结合情况。在SPR的应用中，一般要求作敏感膜的分子一端为可与金或银键合的活性基团，而其另一端为具有分子识别功能的活性基团。巯基丙酸的巯基端可与金膜连接，另一末端的羧基可作为活性基团，用其连接抗体分子，结果良好。

发明内容

本发明的目的是采用波长检测型SPR传感器，研究药物分子与生物分子的相互作用。

本发明通过以下技术方案来加以实现：采用波长检测型SPR传感器，研究药物分子与生物分子相互作用的方法，涉及下列步骤：

1.采用本课题组研制的波长检测型SPR分析仪：由光源1、导光系统2，3，4，10，11、传感元件5，6、流通池7，8，9、分光检测系统12和数据处理系统组成；

2.传感器的制备采用下列步骤：在波长检测型SPR分析仪中，选用玻璃棱镜5作为传感器的传感元件；采用真空镀膜法，在棱镜5的传感面镀约50nm厚的金或银膜，作为传感器的传感膜6；

3.在传感膜6底部的流通池7中注入巯基丙酸(MPA)溶液，待MPA在金膜表面自组装完成后，将磷酸盐(PBS)缓冲溶液注入到流通池7中反复冲洗，以清除传感器表面的非特异性结合；