[发明专利]具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤疫苗，尤其是涉及一种具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽。

背景技术

随着肿瘤分子免疫学与分子生物学研究的进展，细胞毒T细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)介导的特异性细胞免疫成为主要的抗肿瘤机制，研制肿瘤相应的CTL表位肽疫苗，是肿瘤特异性免疫治疗的一种途径，寻找有效的优势CTL表位成为肿瘤特异性免疫治疗及治疗性多肽疫苗研究的重要前提。然而，单一HLA(人类白细胞抗原)限制性CTL表位受MHC(组织相容性复合物)多态性的限制，对不表达该等位基因HLA分子的肿瘤细胞缺乏免疫活性。又由于恶性肿瘤的部分HLA等位基因表达下调，单一HLA限制性表位容易发生免疫逃避而丧失免疫活性。因此，探索HLA多等位基因限制性CTL表位，发展以CTL表位为基础的广谱疫苗，既可以扩大覆盖面又可以降低因HLA表达下调带来的免疫逃避风险。HLA-A2与HLA-A3两个超型在中国人中的总平均分布频率就超过85％，而同一超型识别的肽序列非常相似。因此，采用同时与几种超型具有亲和力的广谱表位就有可能成为覆盖大部分人群的肿瘤表位肽，能够克服MHC多态性的障碍，为研制出覆盖大部分人群的肿瘤表位疫苗奠定基础，但目前还未见诸有关这方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞有明显杀伤活性的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，该肽由九个天然氨基酸残基组成，其序列为：Ala-Leu-Tyr-Gly-Asp-Ile-Asp-Ala-Val(ALYGDIDAV丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)。

选择COX-2(环氧合酶-2)作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。

所述的活性检测材料和试剂为T2A2细胞、T2A3细胞、EC-1、EC-109和EC-9706肿瘤细胞株、RPMI1640培养基、胎牛血清、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL(白介素)-2、IL-4、IL-7、尼龙毛柱、鼠抗人β2微球蛋白、鼠抗人HLA-A2、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG、Brefeldin A、HLA-A分型试剂盒、ELISPOT试剂盒。

将T2细胞、EC-1、EC-109和EC-9706细胞株和人PBMC(外周血单核细胞)，采用常规培养细胞的培养条件均为37℃、5％CO₂饱和湿度，常规传代。

运用SYFPEITHI预测，再基于结构的表位预测算法(MHC-Pred)结构亲和性分析。初选九肽通过蛋白酶体裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)酶切分析进行初筛，经BLAST分析仅与COX-2有同源性。

采用标准Fmoc方案进行合成，经HPLC(高效液相)纯化后，其纯度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。

试验分析：

1、T2细胞结合力试验：将本肽(50μg/mL)加入含β₂微球蛋白(3μg/mL)的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h-24h后，冷PBA(等渗磷酸盐缓冲液)洗涤3次，加100μL稀释度为1∶200的一抗(T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β₂-M)，4℃放置30min。冷PBA洗涤3次后，加50μL稀释度为1∶50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗涤后于流式细胞仪检测。另外，已被鉴定的Flu matrix_58-66(GILGFVFTL)和Flu NP_265-273(ILRGSVAHK)在该实验中分别作为T2A2和T2A3的阳性肽，PBS(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。结果用荧光系数(FI)表示：

荧光系数(FI)＝(表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度