[发明专利]重组牛胰核糖核酸水解酶A的表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组牛胰核糖核酸水解酶A(RNaseA)的表达及纯化方法。

背景技术

随着分子生物学的快速发展和普遍应用，新成立的生物医药公司如雨后春笋般的迅速成长。在涉及生产及制备与人的健康有密切相关产品的生物医药公司，如制药、食品及疫苗，政府相关部门对其生产，制备的流程及所用的原料等都有着严格的要求和标准。例如在制备DNA用以产生第三代疫苗的过程中，需要水解除去大量细胞内的RNAs(核糖核酸)，这就需要添加RNaseA(牛胰核糖核酸水解酶A)来完成。目前已知制备RNaseA的方法以DelCardayre等所发表的文献用生化的方法从牛胰脏提取为代表。而实验室制备重组RNaseA的方法根据已发表的文献可以分为三类：一类是表达量较高，大概40-50mgRNaseA酶/L大肠杆菌，此方法发表于1995年，是将牛的相关基因克隆至pET-22b载体上。但是该方法存在一个主要问题是大部分产生的RNaseA为无活性的蛋白多聚体，须经过变性溶解，再逐渐透析复性等复杂手续来产生少量具有活性的RNaseA，这样的操作耗费大量的时间及成本，且大大降低了生产效率。另一类是将牛RNaseA酶以麦芽糖结合蛋白的融合蛋白形式分泌到细胞周质，具有可溶及较好活性的优点，但是该方法的缺点在于产量太低，小于1mg/L；还有一类是用毕赤酵母表达，将重组RNaseA分泌到培养基中，该方法存在的问题是表达量低，小于5 mg/L，并且大概有一半被糖基化，其活性较正常的RNaseA低得多。目前，市场上出售的核糖核酸水解酶A，主要是由国外进口采用生化方法从牛胰脏中提取。因顾虑疯牛病是一种人畜共患疾病，所以我们不能将从牛胰脏中提取的核糖核酸酶制品安全地应用于医药食品等方面。因此如果我们能利用大肠杆菌大量并经济地生产重组牛RNaseA酶，就会极大地促进以分子生物学为基础而开发的制药、食品及基因疫苗等高科技产业，且将填补目前市面上无重组RNaseA酶的缺憾。随着生物医药科技的发展，对安全的RNaseA的需求会越来越多，所以，开发生产此产品具有重大意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用现代生物学中的基因表达和蛋白纯化技术，提供一个安全可行并获得大量酶产品的方法。使得重组RNaseA的表达量大于100mg/L，并且不需要经过繁复的变性溶解和透析复性等耗时费钱的操作，可直接得到约40mg/L的高活性、高纯度重组RNaseA。

本发明的方案是这样的：将牛的相关基因克隆至表达载体pET-20b，将其转化至大肠杆菌，然后筛选能高量表达且释放具有活性的RNaseA到细胞周质的菌株，并从而纯化该蛋白。流程包括：

1、利用生物信息学找出保守序列，提取牛胰脏的基因组脱氧核糖核酸(Genomic DNA)。

2、设计、合成引物，用PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳验证。

3、用限制性内切酶NcoI及XhoI分别消化PCR产物和表达载体pET-20b(该载体上有信号肽pleb和组氨酸标签，信号肽pleb可以使目的蛋白释放到细胞周质，组氨酸标签方便目的蛋白的纯化)。

4、回收酶切产物并酶连至表达载体pET-20b上，将酶连产物转化至感受态细胞DH5a，抽提质粒，酶切验证并测序。

5、将验证正确的包含牛胰核糖水解酶A基因的重组质粒转化至表达菌株BL21(DE3)pLysS中。

6、挑单菌落到含氨苄青霉素的LB选择培养基中培养，OD₆₀₀达到0.9-1.2时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半.乳糖苷)诱导目的蛋白表达。

7、离心收菌，并加入细胞悬浮液悬浮细胞。

8、采用超声波细胞裂解法破碎细胞，使目的蛋白释放到缓冲液中。

9、验证蛋白表达及其溶解的情况，并筛选表达量高的菌种。

10、用金属亲和柱纯化含组氨酸标签的目的蛋白。

11、检测纯化的重组牛胰核糖水解酶A的活性。

本发明相对1995年所发表的RNaseA的制备方法，做了如下修改：

1)设计引物时，考虑到信号肽和目的蛋白的三维构象，在上游引物的限制性内切酶位点和成熟核糖水解酶A基因之间特异地设计了3个合适的氨基酸，提高了信号肽的剪切效率和成熟重组RNaseA酶的释放及溶解。

2)采用改进的细胞裂解液[加入适当的界面活性剂如Tween-20(吐温20)，NP40(乙基苯基聚乙二醇)]，以有效地裂解细胞并促进释放型RNaseA酶的溶解。