[发明专利]发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及一种生产含低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)的花生四烯酸油脂的方法。

背景技术

花生四烯酸，英文为Arachidonic acid，简称AA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸，它是一种人体必需脂肪酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20：4(n-6)大量研究表明，人体缺乏多不饱和脂肪酸将引起机体功能失调，导致某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸则可预防或治疗这些疾病，如婴儿缺乏花生四烯酸和DHA，可造成永久性智力低下和视力障碍，6-12岁儿童的皮肤瘙痒、眼角干燥、上课注意力不集中，数学成绩下降等症状与其血浆中花生四烯酸和DHA含量低有明显的正相关。同时研究表明，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防和治疗也有显著的效果。世界卫生组织和国际粮农组织针对人类花生四烯酸摄入量的不足，建议在婴儿配方奶粉中添加花生四烯酸，提高婴幼儿的健康水平。因此，花生四烯酸既是一种营养强化剂，同时也是人类重要的保健品。目前市场销售的花生四烯酸产品，主要从深海鱼油中提取，由于原料的限制，花生四烯酸含量低且很不稳定，而且产量低、成本高，无法进行规模化生产。近年来，马泰克生物科学有限公司在中国申请了一项专利，公开号：CN1175976A(名称：花生四烯酸及其生产和使用方法)，它采用高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但仍然存在菌种活性低、油脂产量低、花生四烯酸生产能力低等缺点。武汉烯王生物工程有限公司在中国申请了一项专利，公开号：CN1362522A(名称：用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法)，它采用经离子注入法诱变筛选的一株高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但因采用了离子注入法诱变菌进行生产，不为消费者所认同。而且目前所有公开的专利文献均未对所生产的花生四烯酸混合油脂中的神经酸的含量进行限制，而经研究表明神经酸对婴幼儿的发育具有不良影响，国外的消费群体已对花生四烯酸混合油脂中的神经酸含量提出了限量要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，该方法得到的产品具有花生四烯酸含量高，神经酸、二十碳五烯酸(EPA)含量低的特点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)、菌种活化：

制备活化培养基：200g马铃薯，水1000ml，10-20g葡萄糖，17-20g琼脂，5-10g氮源；

所述的氮源包括但不限于酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾或硝酸钠；

将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25-28℃，培养箱湿度40-50％，培养3-4天，得活化菌种，备用；

2)摇瓶菌种制备：

将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：18-20g/L葡萄糖，10-15g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM，摇床转速为100-250rpm，培养温度为20-30℃，振荡培养3-5天；从培养箱中取出后置于4-10℃条件下保持60-120min，得摇瓶菌种，备用；

3)发酵：

将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8-20％，发酵培养基配方为：碳源10-30g/L，氮源10-21g/L；用1-5mol/L的酸(硫酸、草酸或柠檬酸等)或碱(氢氧化钠或氨水等)调节pH至5.5-7；通入洁净压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM；转速100-200rpm，压力0.01-0.05Mpa，温度20-30℃，期间每隔24h补充10g/L的碳源，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7-9天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。

发酵培养基中的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、淀粉水解糖、乳糖、糊精、蔗糖、玉米糖浆中的任意一种或任意二种以上(含任意二种)的混合物，任意二种以上(含任意二种)混合时为任意配比；发酵培养基中的氮源包括但不限于酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾、硝酸钠中的任意一种或任意二种以上(含任意二种)的混合物，任意二种以上(含任意二种)混合时为任意配比。

发酵培养基的最佳配方为：葡萄糖10-30g/L，酵母膏10-20g/L，硝酸钠1g/L。