[发明专利]应用多重PCR鉴定鸡胚盘性别的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，具体地，属于一种家禽性别鉴定技术领域，涉及应用多重PCR进行鸡胚盘性别鉴定的方法。

背景技术

雌雄鉴别在家禽养殖业有重要作用，通过鉴定早期胚胎的雌雄可以淘汰非目的性别，降低饲养成本，提高经济效益。同时，性别鉴定在基础研究领域更具有重要意义。利用性染色体特异遗传标记对早期家禽胚胎进行性别鉴定，有利于研究在性别分化过程中性激素的合成和表达。家禽分子水平上的性别判定，是研究相反性别家鸡嵌合体的前提。

鸡胚胎性腺在孵化5天时尚未具睾丸和卵巢特征，处于未分化期，孵化6大时，性腺已具卵巢特征，孵化7天时，明显具备睾丸特征，此时卵巢特征更为明显，雌性中右侧的卵巢退化，导致卵巢在两侧发育不平衡；雄性中两侧的睾丸对称发育，这种现象可以在低倍放大镜下观察到，从而可以鉴别出胚胎的雌雄(李碧春等，鸡胚胎性腺发生发育的研究，中国家禽，2001，23(8))，但是这种方法只能鉴定7天以后的鸡胚的性别。

后来，通过研究鸡W染色体上性连锁基因或特异的DNA序列，获得了一些从分子水平上鉴定鸟类性别的方法。从鸡的W染色体克隆出的一个0.6K碱基对EcoRI酶切片段(EE0.6)是一段非重复序列，它还包含一个编码序列-ET15，ET15可能是一种拟基因的一部分。EE0.6片段在所有的鸟类包括在有龙骨形的和走禽中都是保守的，它在W、Z上有一段同源序列，但它们在大部分序列上却存在差异，可以通过选择合适的引物对W染色体上的特异性片断进行扩增，结果雄性不被扩增，而雌性会产生一条扩增带(Itoh Y等，Identification of the sex of a widerange of Carinatae birds by PCR using primer sets selected from chicken EE0.6 andits related sequences，J Hered.，2001，92(4)：315-21；OgawaA等，Molecularcharacterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region fromthe W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinataebirds，Chromosome Res，1997，5(2)：93-101)。CHD基因全称为染色体螺旋蛋白基因，是一个功能性基因。利用CHD基因进行性别鉴定有两个种方法：一是通过PCR利用特异性引物对Z和W两个染色体的特异序列进行扩增，然后用限制性内切酶检测，对PCR扩增产物进行酶切，由于CHD-W基因上有特异性酶切位点，因此对酶切产物电泳时，雌性为三条带，雄性为一条带(刘铸等，CHD基因与非平胸鸟类性别鉴定，生物技术通报，2006，增刊：147-150)；二是直接通过特异性引物对Z和W两个染色体上不同大小的特异序列进行PCR扩增，检测结果将表现为：雌性为两条带；雄性为一条带(马珺等，PCR在鸟类性别鉴定上的应用，上海师范大学学报，2002，增刊：95-97)。但是上述报道的两种性别鉴定的方法只是对于比较丰富的模板有效，对于DNA含量极少的胚盘来说，上述两种方法很难准确鉴定出其性别。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种可靠的用于鸡的胚盘或者早期胚胎的性别鉴别方法。

本发明建立了一种快速、准确地鉴定鸡胚盘性别的巢式PCR的方法，其具体步骤如下：

1)根据GenBank登录号为D85614的鸡EE0.6序列设计两对嵌套式引物，并根据GenBank登录号为NC_006089鸡wisp1基因设计两对嵌套式引物作为内部对照；

(2)提取已知性别的鸡血样基因组DNA，进行引物特异性检验，然后提取待测的鸡胚盘细胞DNA进行PCR扩增，根据扩增的DNA片段大小鉴定鸡胚盘性别。

其中步骤1)扩增所用的引物，具有如下序列：

/EE0.6基因  外引物  正向：5’CAGTTATGGTCCTATGCCTAC 3’；

反向：5’GTAATGGGTTCAGGTTGAGTC 3’；

内引物正向：5’CCTATGCCTACCACATTCCTAT 3’；

反向：5’GTTGGCACTGATTTAGTTCCTT 3’；

/对照序列Wisp1基因外引物正向：5’GTCAAAATGTCCCCTCCTGT 3’；