[发明专利]重组杆状病毒AcBacΔCC－GP41及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术和医药技术领域，特别是涉及一种能够高效表达HIV-1包膜糖蛋白GP41的重组杆状病毒。本发明还涉及该重组杆状病毒的构建方法。

背景技术

目前应用最为广泛的杆状病毒表达载体是商品化的杆状病毒Bac-to-Bac系统，其最常用的杆状病毒载体是苜蓿丫纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(AcMNPV)。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要由供体质粒、穿梭载体bacmid、昆虫细胞组成，因为该方法快捷、方便，整个重组病毒的筛选周期为7～10天，且可以连续筛选，同时，供体质粒可以构筑较多的限制性酶切位点和进行改造，以利于外源基因的插入。

I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)是引起中国艾滋病(AIDS)的主要病原。在HIV-1感染宿主进入靶细胞早期的过程中，其囊膜糖蛋白(GP120和GP41)起着关键性作用。gp41基因片段的变异相对gp120较为保守，其中GP41是HIV-1包膜蛋白编码基因env所编码的跨膜蛋白，可分为膜外区(ecmdomain)、跨膜区(transmembrane)、胞质区(cytoplasmic domain)3个部分，其主要功能是介导病毒膜与靶细胞膜的融合。GP41有较稳定的抗原决定簇，产生的抗体可持续终身。对于HIV入侵细胞的一些机制，尤其是GP41跨膜区、胞质区的结构及在融合中的作用细节目前还不十分清楚，GP41天然构象也未完全了解。对于这些机制的明确还需要进行更深入的研究和探索，而有效表达GP41全长片段有利于对HIV致病机制的认识，开发更有效、更经济、更少副作用的抗病毒药物，以及制备HIV疫苗的有效途径。

从国内外对HIV-1包膜糖蛋白的研究可知，包膜糖蛋白对HIV-1药物的研究有着充分的发展空间。然而由于HIV-1糖蛋白GP41蛋白的穿膜特性造成对宿主的毒性作用，使其全长片段难以有效表达。目前针对GP41通常采用分段、低温诱导等原核表达方法。如“HIVgp41基因分段低温诱导表达”(袁玉华等，《中国病毒学》，2004，19(2)，179-181)，就是用低温表达技术改善GP41蛋白在原核系统中的表达效果。但该文章得到的产物为原核表达产物，因而与天然蛋白有着很大的差别，并且不是全长片段的表达，同时用该方法表达的GP41蛋白的纯化还存在很多困难。

国际专利文献授权公布号WO2005/010033于2006年11月8日公开的《新的可溶且稳定的三聚体形式的GP41多肽》是为了克服GP41蛋白不易表达的困难，而构造了一种经修饰的包含了HIV-1的gp41胞外结构域的N-末端螺旋与C-末端螺旋之间的连接环的多肽，该多肽是具有充足亲水性的可溶性稳定三聚体。但该发明不是全长的GP41蛋白，与天然的GP41蛋白存在着较大的差别。

发明内容

本发明的目的是：提供重组杆状病毒AcBac^△CC-GP41，该重组杆状病毒能够高效表达HIV糖蛋白GP41，表达的GP41蛋白为全长蛋白，其外源蛋白具有更好的抗原活性，且表达后的真核具有修饰功能。本发明的另一目的是：提供重组杆状病毒AcBac^△CC-GP41的构建方法，该方法是利用INVITROGEN公司开发Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，选用AcMNPV杆状病毒载体，通过改造AcMNPV穿梭载体(Ac-bacmid)得到双缺失穿梭载体Ac-bac^△CC，再用昆虫细胞表达体系得到重组杆状病毒AcBac^△CC-GP41。该重组杆状病毒的获得，有利于研究GP41的天然构象，为完整解释HIV-1进入细胞的机制，同时也为基于GP41的免疫诊断、疫苗研发以及艾滋病的防治打下良好的基础。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

重组杆状病毒AcBac^△CC-GP41，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期：2007年5月18日，保藏号：CCTCCNO.V200702。