[发明专利]抗农作物真菌多肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组的抗农作物真菌多肽的基因、重组质粒、多肽及其制备方法。

背景技术

真菌感染是农作物的常见危害，比如造成稻瘟病的真菌稻梨孢每年给我国的稻米生产造成巨大的经济损失，危害性极大。随着我国广大农业地区加速城镇化，生态环境污染和恶化日益加剧，农作物病害发病率直线上升，农作物病害的生态防治已成为我们必需面对和解决的重大问题。

现用抗菌农药对农作物感染真菌疗效不理想；真菌属真核细胞，它和人体细胞的相似性使得农用抗真菌药物如三环唑类在杀伤真菌细胞的同时也杀伤人体细胞。长期使用环唑类等化学药物诱使真菌对其产生了耐药性，而农民为抑制农作物真菌感染往往不惜超剂量多次重复用药，这就造成农作物真菌耐药性进一步加重；同时也造成农药在环境和农产品中的残留量越来越大，因此人类一直在致力于开发高效且无污染的抗真菌农药。

近年来真菌基础研究取得很大的进展，已确定某些真菌如白色念珠菌信息素的氨基酸序列，是14个氨基酸残基组成的多肽。它可以在生活介质中自由游动，具有自动寻找同种真菌细胞胞膜上相应受体的生物学活性。因此可以利用真菌信息素的这种自动寻找活性来诱导大肠菌素这一类细菌外毒素到达这些真菌的细胞膜上形成离子通道来杀伤这些真菌，从而构建出一类新型生物农药。

发明内容

本发明的一个目的是提供新型的重组抗农作物真菌多肽的基因、重组质粒、多肽，此种多肽能特异的杀灭农作物真菌细胞而不会伤害人体正常细胞，且防治效果大大好于现用农药。本发明的再一目的是提供上述重组抗农作物真菌多肽的制备方法。

本发明的技术方案如下：

本发明所述抗农作物真菌多肽的基因，含有编码大肠菌素的基因和编码白色念珠菌信息素的基因。将编码白色念珠菌信息素的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从而获得表达重组抗农作物真菌多肽的核苷酸序列。编码白色念珠菌信息素的基因为序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠菌素E1或Ia或Ib或A或B或N。在本发明的一个优选实施例中，将上述白色念珠菌信息素基因与大肠菌素Ia(SEQ ID NO.1)的羧基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。在本发明的另一个实施例中，将上述白色念珠菌信息素基因与大肠菌素Ia(SEQ ID NO.1)的氨基端基因连接而形成如序列表中SEQ IDNO.6所述的核苷酸序列。

本发明所述重组质粒，是将如上所述的编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素的羧基端或氨基端形成本发明的重组质粒。若选用大肠菌素Ia，则将编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列插入Ia基因的第626位氨基酸后(羧基端)或第1位氨基酸前(氨基端)而形成本发明的诸重组质粒。构建重组质粒的原始商用质粒pET-15b来自于Novagen公司，其中装载了大肠菌素Ia和相应的Immunity蛋白基因，针对白色念珠菌信息素基因设计了数对引物，其序列见实施例1。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司药箱操作获得重组质粒。

本发明的又一方面，提供本发明所述抗农作物真菌多肽的制备方法，将编码白色念珠菌信息素的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗农作物真菌多肽基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组抗农作物真菌多肽的工程菌细胞。用Sepharose High Performance柱分离纯化即获得本发明所述的抗农作物真菌多肽。

本发明所述抗农作物真菌多肽可在制备治疗或预防农作物真菌感染的农药中应用。可以通过将本发明所述的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于农作物使用的农药组合物。其机理是：本发明所述多肽中可与靶真菌细胞表面受体结合的白色念珠菌信息素诱导大肠菌素到达靶农作物真菌细胞膜附近，然后大肠菌素通道形成结构域的疏水区段插入靶真菌细胞膜中，进而大肠菌素通道形成结构域在靶农作物真菌细胞膜上形成离子通道，使靶农作物真菌细胞内容物泄漏而致真菌细胞死亡，从而达到杀死农作物真菌细胞的目的。