[发明专利]检测痕量辣根过氧化物酶的分光光度法

说明书

技术领域：

本发明涉及检测痕量辣根过氧化物酶的方法，特别是一种用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法。

背景技术：

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，简称HRP)是一种非常重要的过氧化物酶，在分析化学、环境科学、临床化学、有机合成等领域均有重要的应用。测定游离HRP和各种HRP标记中HRP的含量可以间接地测定体液和其他组织液中抗体或抗原的量，对于免疫学及组织化学的研究以及临床疾病的诊断具有十分重要的意义。

基于HRP催化H₂O₂氧化无色的苯胺类、苯酚类衍生物，生成具有颜色、荧光或电化学活性的醌式或偶氮类二聚或多聚产物，可用分光光度法、荧光法或电化学方法检测HPR活性和H₂O₂，并广泛用于酶联免疫和酶分析。

现有的测定HRP活性的方法主要有分光光度法，荧光光度法、化学发光法，以及酶联免疫吸附分析法、酶联荧光免疫分析法、电化学酶联免疫分析法等。其中伏安酶联免疫分析法灵敏度较高，但操作比较繁琐。上述方法主要存在两个缺点：第一，所用底物多为苯胺类、苯酚类衍生物，稳定性较差，见光或空气极易被氧化，更为不足的是苯胺类底物具有致癌作用，使它的应用受到限制。第二，HRP是一种对氢供体底物(如酚、胺、抗坏血酸等)缺乏特异性氧化的酶，可以催化氧化多种底物，因而底物类似物对测定也有干扰。因此，研究HRP的新底物和新方法具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法。

本发明目的采用如下技术方案来实现：

本发明研究了阳离子表面活性剂溴代十四烷基吡啶(TPB)-HRP-KI-H₂O₂体系的光度法特征及其分析应用。在酸性条件下，HRP可以催化H₂O₂与过量的I^-反应生成I₃^-，I₃^-与阳离子表面活性剂TPB等形成缔合物微粒(TPB-I₃)_n，该缔合物微粒存在吸收效应，HRP浓度在一定范围内与TPB体系304nm处的吸光度呈线性关系。据此建立一种灵敏度高、选择性好、简便快速测定痕量HRP的光度法。

本发明采用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶。具体检测方法包括如下步骤：

1.在5.0mL的具塞试管中，依次加入HAc-NaAc缓冲溶液、KI和HRP；

2.在步骤1的具塞试管中再加入H₂O₂，摇匀；

3.将步骤2的试管置于温水浴中，再加入TPB，摇匀，用蒸馏水定容至2.5mL

4.将上述所得溶液适量倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上扫描得到体系的吸收光谱，以不加HRP测得的吸收强度为空白；

5.将上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计测定304nm处的吸光度，绘制标准工作曲线，根据标准曲线：A_abs＝0.0801c+0.1252，R²＝0.9981，即可求得辣根过氧化物酶在0.4～3.2ng/mL范围内的浓度。

步骤1所述的具塞试管中，依次加入的HAc-NaAc缓冲溶液，其pH值为4.6～5.2，体积0.2～0.5mL，加入的KI浓度为4×10^-3mol/L～6×10^-3mol/L，加入的HRP浓度为0.1μg/mL，体积为10～80μL；

步骤2所述的加入的H₂O₂浓度为1.0×10^-5～3.0×10^-5mol/L；

步骤3所述的水浴温度为20～30℃，水浴反应时间为25～50min，TPB浓度为2.0×10^-5～6.0×10^-5mol/L；

步骤5所述的测定波长为304nm。