[发明专利]基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测方法，尤其涉及一种基于dU或dI寡核苷酸探针的SNP检测方法，可以用于基因多态性分析和物种分型等，属于生物检测技术领域。

背景技术

SNP作为一种在基因组水平上由单个核苷酸的变异而导致的DNA序列多态性，在遗传病致病基因关联分析、连锁不平衡分析、药物基因组学、患者个性化治疗、法医鉴定、农作物遗传育种等领域有着重要应用。鉴于SNP在现代生命科学中的重要地位，开发了多种SNP测定方法。但是现有SNP测定方法或检测成本高[BMC Genomics，2006，7：291-291]，或操作繁琐，结果不准确，重现性差[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：2674-2678.]，或需要昂贵设备[Nucleic Acids Res.，2005，33：e38.]。现在看来，还没有一种SNP检测技术能够达到结果准确、操作简便、成本低廉、检测通量高的标准。

MutS蛋白特异性结合含有错配碱基的双链DNA，是一种极具潜力的SNP检测工具蛋白。其中来源于嗜热微生物Thermus thermophilus的错配修复蛋白TthMutS，能在高达60℃的温度下有效识别所有8种类型的碱基错配和1到3个碱基缺失/插入引起的错配。

pfu DNA聚合酶广泛应用于聚合酶链式反应(PCR)，用于扩增目标核酸。然而基于pfu DNA聚合酶的SNP检测技术报导很少。这主要是因为pfu DNA聚合酶具有3’外切酶活性，因此引物的3’末端碱基与模板DNA待测SNP位点的碱基不论配对与否，pfu DNA聚合酶均能延伸引物合成全长DNA片段。因此pfu DNA聚合酶不适合于3’末端引物延伸法检测SNP。最近研究表明pfu DNA聚合酶特异性紧密结合DNA中的脱氧尿嘧啶dU核苷酸与脱氨基腺嘌呤dI核苷酸，并停滞在dU或dI处，造成DNA合成反应不能顺利进行。

发明内容

本发明的目的在于针对现有SNP检测技术的不足，提供一种新的SNP检测方法。该SNP检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。

为实现这样的目的，在本发明中，用于测定SNP的dU或dI寡核苷酸探针具有如下特征：全长30-40个核苷酸，其中5’端第15-25位的一个核苷酸为待检SNP位点，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检SNP位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点及其两侧核苷酸配对。SNP测定体系含有dU或dI寡核苷酸探针、待测单链DNA、报告DNA模板分子、报告DNA的正向引物与反向引物、热稳定性mutS蛋白(例如Thermus thermophilus的热稳定性MutS蛋白)和pfu DNA聚合酶等组分。若dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交形成的DNA双链含有错配碱基，则pfu DNA聚合酶不能结合错配碱基附近的dU或dI核苷酸，使得pfuDNA聚合酶能够催化报告DNA的PCR；若dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交形成的DNA双链不含有错配碱基，则热稳定性mutS蛋白不结合在该双链DNA上，而pfu DNA聚合酶可以牢牢结合寡核苷酸探针的dU或dI核苷酸，使得pfu DNA聚合酶不能够去催化报告DNA的PCR。

本发明的具体步骤如下：

1)设计合成测定单核苷酸多态性的dU或dI寡核苷酸探针，dU或dI寡核苷酸探针的序列特征是：探针全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待测单链DNA的待检单核苷酸多态性位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检单核苷酸多态性位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点及其两侧核苷酸配对；

2)设计合成用于扩增报告DNA的特异性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整条引物与报告DNA模板分子中报告DNA两端的碱基序列配对；

3)采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，聚合酶链式反应体系组成：热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测单链DNA模板分子、待测单链DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶，其中待测单链DNA特异性引物中的一条采用5’端生物素标记；扩增双链DNA后，将双链DNA变性，与采用链亲和素包被的磁珠温育，在变性条件下洗涤磁珠，再用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的待测单链DNA；