[发明专利]肿瘤修复基因突变的荧光实时PCR检测方法及试剂系统

权利要求书

1、一种肿瘤修复基因突变的实时PCR检测方法，该方法以检测肿瘤修复基因为目的，使用针对肿瘤修复基因的专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Taqman-MGB检测试剂系统，通过荧光实时定量PCR方法，对肿瘤修复基因的特定位点进行检测；

所述的肿瘤修复基因包括ERCC1，ERCC2，XRCC3基因；

所述的特异性寡核苷酸引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意表记方法或者修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：

引物名称       寡核苷酸序列

ERCC1-118FP    GGAATTACGTCGCCAAATTCC

ERCC1-118RP    GCAATCCCGTACTGAAGTTCGT

ERCC2-312FP    GAGACGGACGCCCACCT

ERCC2-312RP    GGAGGCGGGAAAGGGACT

ERCC2-751FP    CCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCT

ERCC2-751RP    CACTCAGAGCTGCTGAGCAATC

XRCC3-241FP    ATGGCTCGCCTGGTGGT

XRCC3-241RP    CCCTGCCTTGGTGCTCAC

所述水解探针至少包括下述一种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：

探针名称         寡核苷酸及标记集团

ERCC1-118FAM(C)  FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGB

ERCC1-118FAM(T)  FAM-CAGGGCACATTGC-MGB

ERCC2-312FAM(C)  FAM-CTTCGTCGGGCAGCA-MGB

ERCC2-312FAM(T)  FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGB

ERCC2-751FAM(T)  FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGB

ERCC2-751FAM(G)  FAM-CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGB

XRCC3-241FAM(C)  FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGB

XRCC3-241FAM(T)  FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB

其中，FAM代表FAM基团，MGB代表MGB基团；而且FAM可用其他任意用于标记的荧光素替代；

所述的Taqman-MGB检测试剂系统，由以下两部分构成：

一：Taqman-MGB实时定量PCR试剂系统：

(1)5XPCR反应缓冲液：

50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下PH8.3-8.8)

100-500mmol/L KCl

0.5-25mmol/L MgCl₂

25mmol/L二硫苏糖醇

0.25-2.5％Triton X-100；

(2)dNTP

0.5-15mmol/L各种dNTP；

(3)前端引物和后端引物

由所述引物序列合成的引物，各种引物浓度范围：20-200mmol/L；

(4)探针

由所述水解探针序列合成的探针，探针浓度范围：20-200mmol/L；

(5)热启动DNA聚合酶

酶使用量在0.5-5U；

二：DNA提取系统

标本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式离心法或其他方法提取。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其检测的基因突变位点包括：

(1)ERCC1：19007 C＞T；

(2)ERCC2：23591 G＞A；35931 A＞C；

(3)XRCC3：18067 C＞T；

其中：＞表示错配。

3、一种用于肿瘤修复基因突变的实时PCR检测的试剂系统，其特征在于为Taqman-MGB实时定量PCR试剂系统，其组成如下：

(1)5XPCR反应缓冲液：

50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下PH8.3-8.8)

100-500mmol/L KCl

0.5-25mmol/L MgCl₂

25mmol/L二硫苏糖醇

0.25-2.5％Triton X-100；

(2)dNTP

0.5-15mmol/L各种dNTP；

(3)前端引物和后端引物

由权利要求1所述引物序列合成的引物，各种引物浓度范围：20-200mmol/L；

(4)探针

由权利要求1所述水解探针序列合成的探针，探针浓度范围：20-200mmol/L；

(5)热启动DNA聚合酶

酶使用量在0.5-5U。