[发明专利]一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及重组毕赤酵母菌株，特别是指一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法。

背景技术

水蛭素是迄今为止所发现最强的天然的凝血酶特异抑制剂。动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效阻止血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。因此水蛭素可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。

1996年，Rosenfeld等首次在毕赤酵母中分泌表达了水蛭素蛋白，产量达到1.5g/L(Rosenfeld SA等，Protein Expr.Purif.1996，8：476-482)，但是在其文章中没有提到水蛭素的降解问题。2002年张元兴、周祥山、周卫斌等在重组毕赤酵母发酵分泌表达水蛭素时，发现虽然水蛭素的总产量比较高，但在发酵过程中水蛭素存在降解现象，发酵过程中产生了4种具有较高比活的水蛭素异构体，它们分别是目的产物水蛭素Hir65及Hir65的C-末端降解1-3个氨基酸的产物(Zhou XS等，Biotechnol.Lett.2002，24：1449-1453；Zhou WB等，Preparative Biochemistry Biotechnology 2004，34(3)：239-252)。这说明在毕赤酵母中存在一些降解水蛭素的蛋白酶，而且这些蛋白酶对水蛭素的降解程度是比较厉害的，严重影响了水蛭素Hir65的产量，并影响了下游纯化。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法，该菌株能有效减少发酵过程中水蛭素的降解，提高水蛭素的产量，并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。

在本发明的第一方面，提供了一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株，其特点是，所述重组毕赤酵母菌株中含有失活的KEX1基因。

相对于未失活的KEX1基因，所述的失活的KEX1基因的编码区及非编码区插入了或缺失了DNA片段。

所述的失活的KEX1基因的编码区缺失了第289～1728位碱基序列，其编码的蛋白酶缺失了第97～576位氨基酸。

采用所述重组毕赤酵母菌株表达水蛭素的发酵过程中，完整水蛭素占总水蛭素的比例达到了60％～90％，完整水蛭素产量达到了2.9g/l。

在本发明的第二方面，提供了一种制备上述重组毕赤酵母菌株的方法，其特点是，包括步骤：使一种毕赤酵母菌株含有的未失活的KEX1基因失活，从而获得所述重组毕赤酵母菌株。

在所述的未失活的KEX1基因的编码区及非编码区插入或缺失DNA片段。

采用Pop-In/Pop-Out的方法缺失了所述的未失活的KEX1基因编码区的第289～1728位碱基序列，即缺失了其编码的蛋白酶的第97～576位氨基酸。

较佳地，包括步骤：

a.构建KEX1基因体外缺失片段；

b.构建含sh ble基因的pPOPBle载体；

c.将所述KEX1基因体外缺失片段插入所述pPOPBle载体，获得pPOPBleΔkex1载体；

d.线性化所述pPOPBleΔkex1载体，转化毕赤酵母菌GS115Hir。

本发明提供了的KEX1基因缺失的重组毕赤酵母菌株GS115HirΔkex1，采用该菌株表达水蛭素Hir65蛋白，在发酵诱导初期完整水蛭素占总水蛭素的比例达到了90％，到发酵结束时也高于60％。而在相同的发酵条件下，KEX1基因未失活的毕赤酵母菌株中，完整水蛭素占总水蛭素的比例一直只有40％左右。发酵结束后在KEX1基因失活的毕赤酵母菌株中完整水蛭素产量达到了2.9g/l，而在KEX1基因未失活的毕赤酵母菌株中只有1.1g/l。所述本发明的KEX1基因缺失的重组毕赤酵母菌株能有效抑制水蛭素降解，水蛭素表达量显著提高，这样的结果并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。

附图说明

图1a为制备本发明的一具体实施例时扩增出的部分Δkex1片段的电泳示意图一。

图1b为制备本发明的一具体实施例时扩增出的Δkex1片段的电泳示意图二。