[发明专利]一种卵泡刺激素的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及卵泡刺激 素(FSH)的纯化方法，以及含有它的药物组合物。

背景技术

卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，简称FSH)是由垂体产生的激素， 它由α链和β链两个亚基组成。FSH的α亚基与黄体生成激素(leuteinizing hormone，简称LH)和绒毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，简称CG)的α亚 基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天 冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。

FSH的β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24 位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸 组成，分子量约为14800D；CG的β亚基则有145个氨基酸，分子量22000-39000 D。

临床上FSH主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。FSH可以从垂体或 绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。

含有FSH的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它 是FSH与LH比例约为l的混合物。但是，对于体内有较多量的LH而不需加 用外源性LH的患者，LH水平过高会影响卵泡的正常发育，不合时机的抑制减 数分裂抑制因子会导致卵子的老化，从而降低受精和着床的机会。因此对这部 分患者而言，更适合于使用纯FSH制剂。另一方面，过多的LH容易导致多囊 卵巢综合症(Polycystic Ovarian Syndrome，POOS)，研究表明，LH过多对生殖 功能有不利的作用，如引起月经稀发、无排卵、不孕及流产。因此对POOS患 者用纯FSH治疗比HMG更为安全，可减少卵巢过度刺激综合症(Ovarian Hyperstimulation Syndrome，OHSS)危险。

由于上文所述的原因，本领域迫切需要开发出完全不含LH活性的FSH制 剂，以满足患者的治疗所需。

Serono公司推出的Metrodin是一种含有极少量LH的FSH制剂，其后的 Metrodin-HP则是高纯度的FSH制剂。

另外，近年来市场上也开发出一种高纯度的尿促性素(pHMG)，如Ferring 公司的Menopur，它是将纯化后的高纯度FSH与高纯度LH或者是高纯度 hCG(人绒毛膜促性腺激素，human chorionic gonadotropin)按1∶1的比例调配而 成的产品，主要用于替代普通的HMG产品，并克服普通HMG产品中因大量 杂蛋白而造成的对人体的过敏反应。

美国专利号3,674,865描述了从尿提取物中纯化FSH的方法，该方法总共 包括21个不同步骤，得到是FSH和LH的混合物，FSH和LH比例在3∶1～6∶ 1之间。其纯化工艺较为复杂，且所得FSH的比例也较低。

美国专利号6,162,905描述了用离子交换层析、染料层析等多步方法纯化 FSH的方法，但其FSH与LH的免疫效价之比最高也只有313∶1，其中还是有 少量的LH存在。

近年来，通过免疫反应纯化目标物的手段已渐趋成熟。免疫反应是指抗原 与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，两者之所以能够进行特异性结合是 基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一 级结构决定的。抗体是由人或动物体内产生的一种球蛋白，一般由4条肽链组 成，可通过链内二硫键折叠成若干球形功能区，其中的超变区与相应抗原的表 位在空间结构上呈专一性互补关系，如同钥匙和锁的关系，因而两者可发生专 一性的结合反应。

在专利WO98/20039中，描述了用抗FSH的单克隆抗体免疫层析法以及反 相HPLC法来纯化FSH，但由于其免疫层析是吸附洗脱过程，洗脱剂是pH11 的1M氨水，洗脱时容易造成FSH的失活以及单克隆抗体的脱落，对产品存在 一定的影响。

为此，本领域迫切需要开发出一种可用于简单、高效地纯化FSH的方法， 并由此获得几乎不含LH活性的FSH制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的FSH纯化方法，并通过该方法获得 几乎不含LH活性的FSH产品。

在本发明的第一方面中，提供了一种制备卵泡刺激素FSH的方法，所述方法 包括以下步骤：