[发明专利]一种利用FPLC测定脱氧胞苷激酶(dCK)活性方法

权利要求书

1.利用蛋白质层析系统(FPLC)测定脱氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括如下步骤：(1)30℃～40℃，将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，120～150转/min，反应2～3小时，加入冰甲醇终止反应，冰浴5～20分钟后，离心，取上清液；

(2)用Tris-HCl缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。

2.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的反应液包括：2-氯-2-脱氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化镁MgCl₂、氯化钠NaCl、氟化钠NaF、二硫代苏糖醇DTT、dCK，浓度分别为0.1～1mmol/L CdA、1～10mmol/L UTP、1～10mmol/L MgCl₂、10～20mmol/L NaCl、10～20mmol/L NaF、1～2mmol/L DTT。

3.根据权利要求2所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：反应液浓度为1mmol/LCdA、10mmol/L UTP、10mmol/L MgCl₂、20mmol/L NaCl、20mmol/L NaF、2mmol/L DTT。

4.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的反应液用0.005～0.02mol/L的Tris-HCl(pH6.0～8.0)溶液定容。

5.根据权利要求4所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：定容液为0.01mol/L的Tris-HCl(pH7.4)。

6.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述的脱氧胞苷激酶(dCK)是指从小牛胸腺中提取的dCK。

7.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的反应是指37℃，150转/min，反应2小时，冰浴10分钟。

8.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的层析条件是反相液相色谱柱为RESOURCE^TM RPC 1ml，洗脱液A为0.05～0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH6.0～8.0)，洗脱液B为乙腈，平衡为5～10个柱床，冲洗为5～7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在10～20个柱床内由0％线性增加至100％，流速为1～2ml。

9.根据权利要求8所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：洗脱液A为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，平衡为10个柱床，冲洗为7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在20个柱床内由0％线性增加至100％，流速为1ml。

10.根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于：所述的dCK酶活的计算方法：dCK酶活U＝CdA反应量(picomol)/蛋白含量(μg)·h，CdA反应量＝CdA空白标准量-CdA剩余量，CdA剩余量的测定为内标法。