[发明专利]TGF－β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领技术领域，具体涉及一种治疗自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎等等)有关的调节T细胞，以及该调节T细胞的形成方法和应用。

背景技术

目前国内外对系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗依赖于激素类或非激素类的免疫抑制剂。这些药物的治疗虽然能够控制部分病人的症状，但是，远期疗效有限。更重要的是，长期使用这些药物，常常会产生严重的并发症，或者继发严重的感染，甚至会诱导肿瘤的发生。另外花费巨大的医疗资源也是一个缺陷。

二十世纪九十年代中后期，免疫学家发现正常动物和人体内存在着少量的CD4+CD25+细胞(大约占正常人体CD4+细胞的百分之二)。如果缺乏这种细胞，动物和人体会产生各种自身免疫性疾病的症状。试验证明这群细胞来源于胸腺，因为切除胸腺的动物缺乏CD4+CD25+细胞，并且发展自身免疫性疾病。如果注射CD4+CD25+细胞到胸腺切除的小鼠，能够预防小鼠发生自身免疫性疾病。这群细胞现在被称为“自然的CD4+调节T细胞”。

缺乏自然的CD4+CD25+细胞与自身免疫性疾病的关系首先在自身免疫性试验动物模型中得到证实。如BWF1和SNF1小鼠，均在出生22周左右发生自发性的狼疮样疾病，现在的研究证明发病的小鼠体内(外周血和脾脏)CD4+CD25+细胞的数量是下降的。相反，静脉注射CD4+CD25+细胞到这个小鼠，的确能够延缓狼疮疾病的发生和发展。

上述CD4+调节T细胞的性质变化与人的SLE发生和发展也有密切的关系。最初的几个研究小组首先发现活动期的SLE病人的CD4+CD25+细胞数量有明显降低。最近发现，Foxp3基因和蛋白可特异性地表达在CD4+调节T细胞中，并且与CD4+调节T细胞的发育和功能有密切关系。这样，鉴定Foxp3+而不是CD25+细胞的数量，就能够精确的反映自然的CD4+调节T细胞的水平。实际上，我们最近发现活动期SLE病人的CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量是下降的，并且这种下降与疾病的活动程度成反比。另一些人最近也报导了SLE病人的CD4+CD25+细胞的抑制功能是下降的。

既然自然的CD4+调节T细胞明显地影响着SLE疾病的发生和发展，人们试图考虑用CD4+调节T细胞来治疗SLE。由于CD4+CD25+Foxp3+阳性细胞的数量非常有限，研究人员考虑用扩增的方法，来提高CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量。虽然几个研究小组证明了扩增的CD4+调节T细胞仍然能够维持免疫调节功能和表型，并且在预防和治疗急性移植物抗宿主反应中起了一定程度的作用，但是，另外一个欧洲的研究小组发现反复扩增的自然CD4+调节T细胞会失去免疫抑制效果。另外，扩增的CD4+调节T细胞容易发生激活诱导的淋巴细胞死亡，这也限制了这个细胞的治疗价值。

最近，仅仅一个研究小组(美国加州大学旧金山分校，BLUESTONE教授)使用了扩增的CD4+CD25+细胞来治疗动物(BWF1)小鼠的LUPUS疾病。无论如何，这个效果是非常有限的。并且，他们使用的细胞是扩增的正常的动物CD4+CD25+细胞而不是狼疮疾病来源的CD4+CD25+细胞，因为狼疮和SLE疾病的CD4+CD25+细胞可能发生了内在的缺陷。因此，是否能够扩增这些细胞来治疗SLE和另外一些自身免疫性疾病仍然不清楚。可见，这个发现对SLE病人的调节T细胞治疗仍然是有限的。

发明内容

本发明的目的在于提出一种针对自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎等)的TGF_β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用。

本发明提出的针对自身免疫性疾病的TGF_β诱导的调节T细胞，是由TGF_β和IL_2两个细胞因子相结合，通过体外诱导自身免疫性疾病患者的CD4+细胞而获得，具体记为CD4++CD25+Foxp3+调节T细胞，这里FoxP3为FoxP3基因或蛋白。

上述CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞的形成方法如下：

(1)从自身免疫性疾病(如SLE)患者静脉中抽取外周血，用FICOLL技术分离淋巴细胞；再用单克隆抗体(例如抗单核细胞抗体，B细胞抗体，CD8+细胞抗体和记忆细胞抗体等)和阴性技术分离NAIVE_CD4+细胞；

(2)对分离出的NAIVE_CD4+细胞，用抗CD3/CD28抗体包裹的微粒珠子进行刺激；然后加入3-10ng/ml的TGF_β和15-30unit/ml的IL_2，培养5-6天；