[发明专利]利用基因组改组技术改良多拉菌素生产菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域；更具体地，本发明涉及一种制备原生质体融合 的菌株的方法，利用所述方法可进行各种工业菌株(如多拉菌素生产菌)的育 种和改良。

背景技术

在工业微生物育种中，原生质体诱变与原生质体融合技术已经被广泛应 用，并取得了良好的效果。而将两者相结合的诱变融合技术也被不断应用与发 展，尤其是基因组改组(Genome Shuffling)技术的诞生，为工业微生物的育种 带来了新的思路。

在一般的原生质体融合中，都会使得两亲本带上可以识别的选择性遗传标记 以筛选融合子。然而，目前传统采用的选择性标记主要是整合型标记、抗药性 标记、营养缺陷型标记等。利用上述这些传统的标记存在的问题是操作难度大、 步骤烦琐、成本高，有些标记可造成对染色体的损害，并且有些标记在加上后 无法通过简单的手段脱去标记，而抗性标记的存在经常会造成菌株中目的蛋白 产量的下降。

因此，本领域迫切需要找到一种适合用于工业微生物育种的，易于操作的菌 株选择标记手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备原生质体融合的菌株的方法。

本发明的另一目的在于提供利用所述方法进行多拉菌素生产菌育种和改 良的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备原生质体融合的菌株的方法，所述方法 包括：

(1)在适合原生质体融合的条件下，将第一亲本菌株与第二亲本菌株进行 混合，形成第一亲本菌株与第二亲本菌株的混合物，

其中，第一亲本菌株含有携带第一抗性标记的质粒，第二亲本菌株含有携 带第二抗性标记的质粒，并且所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的； 和

(2)从所述混合物中选出耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，从而 获得原生质体融合的菌株。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括步骤：

将携带第一抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第一亲本菌株；和/或

将携带第二抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第二亲本菌株。

在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤(3)：从所获得的原生 质体融合的菌株中，进一步选出性能改良的菌株。

在另一优选例中，在步骤(3)之后，还包括：以选出的性能改良的菌株作 为第一亲本菌株和/或第二亲本菌株，重复步骤(1)-(3)1-1000次，从而获 得性能优异的菌株。

在另一优选例中，在步骤(2)之后还包括步骤：去除原生质体融合的菌株 中携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒。

在另一优选例中，所述去除步骤是：在非抗性选择的条件下，继续培养所述 原生质体融合的菌株(如培养2-20代)，从而选择出脱去携带第一抗性标记的 质粒和/或携带第二抗性标记的质粒的原生质体融合的菌株。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株是经诱变处理的。

在另一优选例中，第一抗性标记或第二抗性标记选自(但不限于)：氨苄 青霉素抗性标记(Amp)，阿伯拉霉素抗性标记(Apra)，壮观霉素抗性标记 (Spc)，硫链丝菌素抗性标记(Tsr)，卡那霉素抗性标记(Kn)，四环素抗性标 记(Tetr)，氯霉素抗性基因(Cmr)。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和第二亲本菌株来自相同的属或种。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株选自(但不限 于)：链霉菌、细菌、糖多孢菌、刺糖多孢菌等。

更佳地，所述的链霉菌是除虫链霉菌。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株是bkdF基因和 olmA1基因中断的除虫链霉菌。

在本发明的第二方面，提供一种改良多拉菌素生产菌的方法，所述方法包括 步骤：

(a)将除虫链霉菌的bkdF基因中断，获得第一除虫链霉菌；

(b)将除虫链霉菌的olmA1基因中断，获得第二除虫链霉菌；

(c)将步骤(a)获得的第一除虫链霉菌和步骤(b)获得的第二除虫链霉菌进 行原生质体融合，获得bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌；