[发明专利]一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生化工程领域，具体涉及一种高产核苷磷酸化酶的菌种及应用该菌种酶法合成阿糖嘌呤类核苷的方法。

背景技术

阿糖嘌呤类核苷有阿糖腺苷，二氨基阿糖腺苷，阿糖肌苷等，其化学结构式如下。

阿糖腺苷                       二氨基阿糖腺苷                     阿糖肌苷

其中阿糖腺苷具有广谱抗病毒的作用，对单纯疱疹病毒I、II型、带状疱疹病毒的作用明显，对腺病毒、EB病毒、牛痘病毒、巨细胞病毒及乙型肝炎病毒(HBV)等亦有抑制作用，对核糖核酸(RNA)病毒也有一定的抑制作用。临床上可静脉注射或外用。阿糖腺苷还是阿糖腺苷单磷酸重要中间体，而后者作为注射剂使用优势明显。二氨基阿糖腺苷和阿糖肌苷也有一定的抗病毒作用，更是昂贵的生化试剂，用于生化研究。

目前，阿糖嘌呤类核苷的制备可有下列方法：

1)发酵法

从Streptomyces antibioticus发酵液中分离得到阿糖腺苷(Juichi Awaya，Journal ofantibiotics.1979，10：1050-1054)。此方法发酵单位低(几十毫克每升发酵液)，提取困难，发酵周期长，且发酵液中混有其它化合物，不适合于大规模工业化生产。

2)化学合成法

化学合成方法有三类：(1)卤代糖与嘌呤经保护、缩合、水解等反应制备。(2)半合成法：由木糖腺苷或核糖腺苷经-些反应使2′-羟基转位。(3)全合成法：由D-阿拉伯糖经噁唑烷合成嘌呤糖苷。(1)法得到的是α和β构型的混合物，步骤长，收率低。(2)法反应步骤也长，且须经层分离。(3)法原料来源方便，步骤较短，特别是合成的产物具有立体专一的特点，而且从噁唑烷开始，反应的中间体不需分离。目前我国主要采用化学合成法生产阿糖腺苷。但是化学合成过程均需基团保护、脱保护反应、手性试剂和其它特殊防护，其工艺复杂、成本高、收率低(≤20％)、易造成环境污染。

3)酶化学合成法

先用化学法合成阿糖尿苷(Ara-U)或阿糖5-甲基尿苷(Ara-5MU)，再与嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)和尿苷磷酸化酶(UPase)的作用下，进行碱基和核糖基的交换反应。酶法合成阿糖嘌呤类核苷可用分离提纯的酶或完整细胞进行催化。有许多文献报道了酶法合成阿糖嘌呤类核苷，如文献(Takashi Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(4)：1053-1058；Takashi Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(8)：2425-2430；Tskashi Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(7)：2167-2171；郑一敏，生物学杂志，2002，19(6)：20-21；郭勇莉，生物技术，2006，16(1)：32-35)。

这些酶化学法虽然有些可以获得较高的收率，如90％以上，但是使用阿糖尿苷的量是嘌呤的三倍，浪费严重，且酶转化时间长达24小时以上，酶反应难以控制等缺点。

发明内容

发明人为克服上述酶化学法合成阿糖嘌呤类核苷存在的酶转化时间长达24小时以上，酶反应难以控制等技术缺陷，进行了广泛的研究。最终提供一种产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)新菌种，该菌种具有高活力的嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，  应用该菌种为酶源制备嘌呤类阿糖核苷的方法。该方法应用阿糖尿苷或阿糖5-甲基尿苷为阿糖供体，摩尔转化率最高可达90％以上，且酶反应时间大为缩短。大大增强了反应效率，降低了生产成本，适合于工业化生产。

本发明的构思是这样的，以产气肠杆菌完整细胞为酶源，主要利用嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，在微生物非增殖的情况下进行酶转化生成阿糖嘌呤类核苷。

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种产气肠杆菌DWOQ-58，以提高嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力与产量。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种生产阿糖嘌呤类核苷的方法。