[发明专利]一种重组植物病毒的化学灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组植物病毒的化学灭活方法。

背景技术

病毒灭活的研究较多的是涉及动物病毒的灭活。灭活的方法主要包括光化学法、过氧化物、醇类、酚类、含氯消毒剂等化学灭活方法，以及γ射线、加热法、巴氏灭活法等物理灭活方法。β-丙内酯(β-Propiolactone)是一种杂环化合物，其作用是通过与嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应改变核酸结构，达到灭活的目的。而同时它对蛋白的影响或破坏作用很小。到目前为止，β-丙内酯用于植物病毒的灭活还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组植物病毒的化学灭活方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组植物病毒的化学灭活方法，其特征在于该方法采用β-丙内酯对重组植物病毒进行灭活。

上述的重组植物病毒粒子稀释至浓度不大于1ug/ul的病毒溶液；将所述的β-丙内酯和病毒溶液按1∶1000～1∶500的体积比混合，搅拌混匀，4℃放置72时灭活；37℃水浴中放置至β-丙内酯完全水解完毕；

上述的重组植物病毒为重组烟草花叶病毒。

上述的重组烟草花叶病毒是采用外源展示法，将外源蛋白插入到烟草花叶病毒外壳蛋白CP的羧基末端，与CP形成融合蛋白，而形成的重组烟草花叶病毒。

上述的重组烟草花叶病毒是在CP蛋白第152～158位氨基酸之间，插入外源小肽。

上述的灭活方法，在高效灭活重组病毒粒子的前提下，对重组病毒外源多肽的后续利用无影响。

附图说明：

图1为不同处理的1ug/ul病毒接种敏感烟草两周后，对新叶总RNA进行RT-PCR检测，引物分别为Pst(-)和Acc2(+)。若检测不到重组病毒基因组条带，说明病毒已灭活。

Lane 1：负对照(以H₂O为模板)

Lane 2：正对照(以TMV为模板)

Lane 3：正对照(以TMVS1241为模板)

Lane 4：1∶8000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 5：1∶6000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 6：1∶4000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 7：1∶2000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 8：1∶1000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 9：1∶500β-丙内酯处理的TMVS1241

图2.不同处理的1ug/ul病毒接种敏感烟草两周后，对新叶总蛋白进行SDS-PAGE检测。若检测不到病毒CP特征性条带，说明病毒已灭活。

Lane 1：Mock健康烟草

Lane 2：野生型TMV

Lane 3：未处理的TMVS1241

Lane 4：1∶8000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 5：1∶6000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 6：1∶4000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 7：1∶2000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 8：1∶1000β-丙内酯处理的TMVS1241

Lane 9：1∶500β-丙内酯处理的TMVS1241

图3.为不同处理的1ug/ul病毒接种敏感烟草，接种两周后烟草新叶的症状。花叶症状消失说明病毒已灭活。

A：1∶500的β-丙内酯处理的TMVS1241

B：1∶1000β-丙内酯处理的TMVS1241

C：1∶2000β-丙内酯处理的TMVS1241

D：1∶4000β-丙内酯处理的TMVS1241

E：1∶6000β-丙内酯处理的TMVS1241

F：1∶8000β-丙内酯处理的TMVS1241

G：未处理的TMVS1241

图4.为1∶500和1∶1000两个处理浓度灭活后的TMVS1241盲传三代，敏感烟草症状图。若无花叶症状，说明病毒已彻底灭活。

A为1∶500转接第二代，两周后症状

B为1∶500转接第三代，两周后症状

C为1∶1000转接第二代，两周后症状

D为1∶1000转接第三代，两周后症状

图5.灭活后的病毒粒子SDS-PAGE分析。融合CP未出现降解条带，说明重组TMV病毒表达的外源小肽的完整性未受影响。