[发明专利]采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法

说明书

技术领域

本发明属无机材料及生化分析技术领域，具体涉及一种超顺磁性的具有核壳结构的金属氧化物包覆四氧化三铁磁性微球应用于分离富集磷酸化肽段的方法。

背景技术

蛋白质的磷酸化在调节生命过程中发挥着重要的作用，因此研究复杂混合物样品中的磷酸化蛋白对于揭示生命过程的调节机制是非常有意义的。生物质谱是解析磷酸化肽段结构的有力手段，但是由于磷酸化肽段的离子化效率相对较差，因此样品中非磷酸化肽段信号严重干扰了磷酸化肽段的检测。因此，在质谱分析之前对磷酸化肽段进行预分离富集是非常必要的。目前，固定金属离子亲和色谱(IMAC)是广为采用的分离富集磷酸化蛋白和肽段的有效方法。然而，该技术采用的基体材料为大孔树脂，富集到孔中的磷酸化肽段无法被质谱检测到，即所谓的“孔洞效应”。但是固定金属离子亲和色谱材料中金属离子是螯合在基体材料上，对使用体系条件要求相对较高。

近年来，人们热衷于新的IMAC基体材料的研究。随着磷酸化肽段分离鉴定方法的快速发展，研究者们发现很多金属氧化物都能选择性地分离富集复杂样品中的磷酸化肽段。金属氧化物以其高选择性和较好的结果重现性成为分离富集磷酸化肽段的又一有力手段。金属氧化物可采用装填成柱子或是直接离心分离的方法用于分离富集磷酸化肽段。装柱使用相对复杂；使用高速离心，仍存在两点不足：操作费时费力；高速离心可能造成“共沉淀效应”，即高质量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段共沉淀下来。而采用磁性材料为基体，利用材料的超顺磁性就可以有效地解决以上存在的问题。将磁性分离和金属氧化物的选择性结合起来，可实现混合物中磷酸化肽段的快速简单富集。因此，合成结构紧密且具有完整核壳结构的包覆金属氧化物的磁性材料，更好地利用磁核的分离性能和金属氧化物外壳对于磷酸化肽段的选择性能，以便更好地实现对于磷酸化肽段的选择性富集是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量磷酸化肽段进行高选择性富集的方法。

本发明涉及的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球，是在超顺磁性Fe₃O₄微球外部包覆碳层作为模板，进而包覆金属氧化物，然后灼烧去除碳层的方法制备而得，结构紧密。其核为Fe₃O₄，粒径为100-300nm，外壳为金属氧化物层，厚度为30-50nm。这里金属氧化物包括TiO₂、Al₂O₃、Ga₂O₃、ZrO₂、In₂O₃或Ce₂O₃等。

本发明中采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球的制备方法为：在Fe₃O₄微球外部包覆碳层作为模板，进而包覆金属氧化物，然后灼烧去除碳层。其合成路线如图1所示。

本发明提出的分离富集磷酸化肽段的方法，是将上述具有核壳结构的金属氧化物磁性微球直接放入含有磷酸化肽的复杂肽段混合物中，进行痕量磷酸化肽选择性富集，无需特殊处理；富集好后，采用磁场对富集的磷酸化肽和其他样品的分离，无需离心，所以可以克服传统离心造成的非磷酸化肽的共离心沉淀问题；然后对富集样品进行洗脱，也可不洗脱，直接进行分析，克服了样品洗脱过程造成的样品损失问题。并且该材料不存在传统材料的“孔洞效应”，可直接用于基质辅助激光解析离子化质谱分析，方法简单实用有效。

本发明中，上述富集体系的pH值为1-6，磷酸化肽样品浓度为0.05-5ng/μL，超顺磁性微球量是10-1000μg/1mL样品，富集时间在30秒-90分钟，富集温度为20-45℃，样品洗脱体系pH值为10-14，洗脱时间为5-60分钟。磁性微球的用量为10-1000μg/L样品。本发明可用任何一种合成的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球，其溶液分散性非常好，体系均匀稳定，有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。