[发明专利]一种新型非限制性核酸内切酶在大肠杆菌中的表达及应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产一种非特异性核酸内切酶的方法。该酶能降解各种形式的核酸(包括DNA及RNA)，可用于除去以核酸为杂质的生物材料中的核酸或排除由核酸引起的影响。

背景技术

非特异性核酸内切酶是一类能够降解各种形式DNA和RNA的水解酶，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸，且对核酸没有序列要求。可用于除去生物材料中的核酸或排除由核酸引起的干扰。

这类酶的典型代表是来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶，已经商品化，商品名该酶的基因已被克隆和在大肠杆菌中表达，由于该酶具有信号肽，生成的核酸酶被分泌到周质和培养基等不同部位。到目前为止，该酶主要是从培养基中分离纯化都得到的。但是，只有少量的酶被分泌到胞外，还有不少在周质和以无活性的前体包涵体形式存在于胞内。有人将包涵体增溶和复性，虽得到了具有活性的酶，但由于是前体蛋白，有一段信号肽，所以比活不高。因此，该酶的产量较低，工艺繁琐，价格偏贵，不利用于在我国使用。

来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶与来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶同源，生物功能极其相似。来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶的基因也被克隆、测序和在大肠杆菌中表达，也具有信号肽，也属于分泌表达。但与其他非特异性核酸内切酶相比，它有一个显著特征，就是它具有一个天然的抑制剂蛋白，能对抗该酶在胞内的毒性。

发明内容

为了提高非特异性核酸内切酶的产量、简化工艺、降低价格、扩大其使用，本发明利用来源于Anabaena sp.的非特异性核酸内切酶具有天然抑制剂蛋白的性质，改变了非特异性核酸内切酶原有的表达形式，既改分泌表达为胞内高效表达，采用强启动子以无活性的包涵体形式在胞内大量表大，在表达该酶的同时，一起表达其天然抑制剂蛋白，以消除极少量有活性的核酸酶对细胞的强毒性，并利用蛋白质工程技术置换掉一个非活性中心氨基酸，减少了复性时形成多聚体的可能性，提高了复性效率。从提高表达效率和复性效率两方面提高了产量。

通过化学合成法合成来源于Anabaena sp的非特异性核酸内切酶基因(SEQ IDNO.1)及其抑制剂蛋白基因(SEQ ID NO.3)。

采用定点突变技术将非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突变为A得到突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5)，在相应表达的蛋白中第166位的Cys就变为Ser(SEQ ID NO.6)。

采用反向PCR技术用抑制剂蛋白基因(SEQ ID NO.3)取代pLysE质粒(Novagen公司产品)中的溶菌酶基因，再用改造后的的质粒转化BL21(DE3)细胞，作为表达突变的非特异性核酸内切酶的宿主细胞(已含有表达抑制剂蛋白基因的质粒)。

采用标准PCR技术去除突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5)信号肽，加入起始密码子ATG，并在起始密码子(ATG)后引入6个组氨酸密码子(CATCACCATCACCATCAC)，得到新的序列(SEQ ID NO.7)，相应得氨基酸序列为(SEQID NO.8)。在片断的首尾引入合适的限制性酶切位点，装配入质粒pET-11a(Novagen公司产品)转化宿主细胞(已含有表达抑制剂蛋白基因的质粒)，完成工程菌的构建。

将构建好的工程菌发酵，离心得到菌体，洗涤后破菌。再离心得到包涵体，洗涤包涵体后增溶溶解，溶液离心后采用镍粒子亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白通过透析复性，加入稳定剂后低温储存。

附图说明

图1、人工合成Anabaena sp的非特异性核酸内切酶全基因(SEQ ID NO.1)装配于pUC18质粒中得到新质粒pUC18-nse的图谱。

图2、人工合成抑制剂蛋白全基因(SEQ ID NO.3)装配于pUC18质粒中得到新质粒pUC18-inh的图谱。

图3、采用定点突变技术将质粒pUC18-nse中第930位的T突变为A(非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突变为A、得到突变的非特异性核酸内切酶基因(SEQ ID NO.5))，得到突变的新质粒pUC18-nse-mut的图谱。

图4、采用反向PCR技术扩增pLysE质粒中的非溶菌酶基因并引入限制性内切酶位点，环化后得到的新质粒pLysE-(+)的图谱。