[发明专利]一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽 Attacin的多肽片段attP1，编码该多肽片段attP1的DNA序列，含有该DNA 序列的表达载体、转化体和重组多肽片段attP1的制备方法，以及多肽片段 attP1的用途。

背景技术

抗菌肽是20世纪70年代研究昆虫免疫系统时发现的一类具有抗菌特性 的小分子多肽。昆虫抗菌肽具有分子量小、热稳定高、水溶性好、杀菌力强、 抗菌谱广等优点，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，而 对正常真核细胞无毒害作用。这就使得研究人员对抗菌肽产生了浓厚的兴 趣，并在诱导释放、抗菌机理、结构功能、重组表达等各个方面进行了深入 的研究。

随着传统抗生素长期广泛使用及人为滥用等因素，细菌及其他微生物的 耐药性问题日趋严重，一些常见的临床致病菌的耐药情况尤为突出。耐药菌 问题已成为当今全球的公共健康问题。人们在对传统抗生素不断进行改造的 同时，也积极研究和开发新型抗生素。抗菌肽具有对病原微生物的广谱性、 选择毒性、不易产生耐药性等特点，被认为是解决细菌耐药性问题的有效途 径之一。现已有将抗菌肽应用于保鲜剂、化妆品如护肤霜等方面的报道。

此外，随着人们对食品和环境质量的要求越来越高，对抗生素的副作用 认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。应 用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲 料学科的一项重要内容。因此应用生物技术研究与开发新型抗菌剂——抗菌 肽也是我国饲料科学界一项紧迫的任务。

Attacin是一类昆虫抗菌肽，一般由180～270个氨基酸残基组成。由于 提取生物体内的天然抗菌肽工序繁、得率低，因此，进行抗菌肽的基因克隆 表达研究并改良出具有无毒性、高效的新型抗菌肽显得至关重要。尤其是 Attacin分子量比较大，作为药用的时候，具有比较强的免疫原性，故应用基 因重组技术进行改造，降低分子量显得尤为迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是提供一种抗菌肽Attacin的多肽片段及编 码其核苷酸序列，该多肽片段具有与全长Attacin相当的抗菌活性。

本发明人经过试验筛选出来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)的 抗菌肽Attacin，其全长由180个氨基酸组成，cDNA序列共有540bp(GenBank Accession#：AY607104)。本发明截取其1-297位核苷酸序列，得到截短的多 肽片段attP1的编码基因，然后将其导入表达载体，再转化宿主细胞得到转 化体，培养转化体进行表达，利用载体上附加的His-tag进行截短的多肽片 段attP1的分离纯化以及western blot验证，最后对纯化的attP1多肽进行抗 菌活性实验。抗菌活性试验结果表明，截短的多肽片段attP1有着与全长的 抗菌肽attacin相似的抗菌活性。

因此，本发明一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽 Attacin的多肽片段attP1，其具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列， 共有99个氨基酸组成。显然，SEQ ID No.2是其成熟肽的氨基酸序列，根据 本发明，所说的“多肽片段attP1”当然也包括本领域技术人员所知的将SEQ ID No.2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加且具有相 同酶活性的由其衍生的多肽或蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个 或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、前导序列、分泌序列或用来纯 化此多肽的序列或蛋白原序列等；一个或多个保守性氨基酸残基被取代；或 成熟多肽与另一化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合 所形成的多肽；也可以是一个或氨基酸残基中具有取代基团的多肽。

其次，本发明还提供一种核苷酸序列，其是下列核苷酸序列之一：

1)编码上述多肽片段attP1的cDNA，可以是抗菌肽Attacin第1-297位 核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示；

2)与核苷酸序列1)完全互补的核苷酸序列。

再者，本发明还提供包括上述核苷酸序列的表达载体；优选地，该表达 载体是由所述核苷酸序列连接于质粒pET28a构成的质粒pET28a-attP1。