[发明专利]一种精子荧光染色测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及荧光染色，尤其涉及核酸染色，更涉及精子荧光染色。

背景技术

精子密度、精子膜完整性以及精子的运动状态是临床男科实验室评估精液质量的最常用的指标。使用计算机辅助精子分析(CASA)可以较精确的提供精子动力学的量化数据，但目前临床上用的CASA不能用于精子密度的检测，因为它难以将精子从非精子的颗粒碎片中区分开来。CASA系统的另一个缺点是不能区分不动的精子和死精子，特别是需辅助生殖治疗的男性患者，如果不动精子(D级)的百分数超过50％，则应检测精子的存活率，而且存活率评估可核查精子活力评估的准确性。

精子存活率检测最常用的是伊红染色和精子尾部低渗膨胀试验，两种方法最大的缺点是重复性差，不同实验室间的结果差异很大，而且操作过程中，对精子的活率有显著的影响，有的精子甚至已经不动了。

因此，本领域迫切需要提供一种荧光染色方法，它能准确区分死细胞和活细胞，对非细胞成分拒染，同时又没有细胞毒性，即染料的加入不影响细胞正常的生命活动，那么DNA荧光染色CASA代替现有的CASA指日可待了。

发明内容

本发明旨在提供一种精子荧光染色测定方法。

本发明的另一个目的是提供染料碘化丙啶(PI)和Transgreen在精子荧光染色测定中的用途。

本发明的再一个目的是提供一种试剂盒，用于精子存活率荧光染色测定。

在本发明的第一个方面，提供了一种精子荧光染色测定方法，它包括步骤：

(1)将精子、菲啶类染料和花菁类染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶类染料选自碘化丙啶、溴乙锭；花菁类染料选自Transgreen；

(2)测定混合溶液中精子的荧光值。

在另一优选例中，它包括步骤：

(1)将精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；

(2)计数混合溶液中绿色精子和/或红色精子的个数，其中绿色精子是活精子，红色精子是死精子。

在另一优选例中，计数混合溶液中大于等于200个精子中绿色精子的个数。

在另一优选例中，混合温度为20-37℃，更佳地为30-37℃。

在另一优选例中，所述的步骤(1)为：将精子和碘化丙啶混合3-15分钟后，加入Transgreen，得到混合溶液。

在另一优选例中，精子和碘化丙啶混合5-10分钟，更佳地，为4-9分钟。

在另一优选例中，加入Transgreen混合5-20分钟，进行步骤(2)的测定。更佳地，加入Transgreen混合3-10分钟。

在另一优选例中，精子和碘化丙啶混合的溶液浓度为12-48uM。

在另一优选例中，精子和碘化丙啶混合的溶液浓度为18-36uM，更佳地，为21-30uM。

在另一优选例中，所述的步骤(1)为：将精子和Transgreen混合3-15分钟后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。

在另一优选例中，精子和Transgreen混合5-10分钟，更佳地，为4-9分钟。

在另一优选例中，加入碘化丙啶混合2-10分钟，进行步骤(2)的测定。更佳地，加入碘化丙啶混合3-7分钟。

在另一优选例中，精子和Transgreen混合的溶液浓度为50-200nM。

在另一优选例中，精子和Transgreen混合的溶液浓度为75-150nM，更佳地，为90-120nM。

在另一优选例中，所述的步骤(1)为：将精子、碘化丙啶和Transgreen一起加入，得到混合溶液。

在另一优选例中，精子、碘化丙啶和Transgreen一起加入后混合10-30分钟，较佳地为10-20分钟，更佳地为15-20分钟。

在本发明的第二方面，提供了一种菲啶类染料和花菁类染料形成的复合染料的用途，所述的复合染料用于精子存活率荧光染色测定。

在另一优选例中，所述的菲啶类染料选自碘化丙啶、溴乙锭；花菁类染料选自Transgreen。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，它含有：

(a)菲啶类染料，所述的菲啶类染料选自碘化丙啶、溴乙锭；和

(b)花菁类染料，所述的花菁类染料选自Transgreen。

据此，本发明提供了一种荧光染色方法，它能准确区分死细胞和活细胞，对非细胞成分拒染，同时又没有细胞毒性，即染料的加入不影响细胞正常的生命活动。

附图说明

图1显示了Transgreen染料和PI染料对精子运动参数的影响，即各组在不同时间测定的活率；其中