[发明专利]香菇野生43菌种的分子特异标记及方法与应用

权利要求书

1.一种香菇野生43菌种的分子特异标记，其特征在于：特异性PCR扩增引物对序列为5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′；DNA片断大小为400bp。

2.一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，包括如下步骤：

(1)菌丝培养和基因组DNA的提取；

(2)香菇菌株野生43的特异DNA片断的获得；

(3)特异PCR扩增引物的获得；

(4)用特异PCR扩增引物对对野生43菌株进行SCAR-PCR扩增；

(5)电泳检测。

3.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中香菇菌株野生43的特异DNA片断是通过采用PCR技术，经过大量的筛选试验，采用简单重复序列引物获得，将该片段克隆测序。

4.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)中特异PCR扩增引物通过下列方法获得：以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。

5.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤：将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化，两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周，收集菌丝，放入-20℃冰箱冻存；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/μL，-20℃冰箱贮藏备用。

6.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中的SCAR-PCR扩增：扩增体系总体积为：25μL，扩增体系：10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香菇野生43菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH₂O 18.6μL，PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，65℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

7.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增反应体系中加入ITS(Internal TranscribedSpacer)，通用引物对(ITS1、ITS4)。

8.如权利要求2所述的一种香菇野生43菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(5)电泳检测为：取步骤(4)PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。

9.一种香菇野生43菌种的分子特异标记在香菇野生43菌种的快速鉴定和检测中的应用。