[发明专利]一种抗人Nogo－66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白疫苗的制备，尤其涉及抗人Nogo-66受体(NgR)蛋白疫苗的制备方法及其在脊髓损伤修复治疗中的应用。

背景技术

目前已发现的来源于髓鞘的轴突再生抑制分子主要有三种：Nogo-A，MAG和OMgp。这三种分子结构明显不同的蛋白质却有着一个共同的受体，即Nogo-66受体(NgR)。NgR能够以高亲和力与这三种抑制分子结合，并将其抑制轴突再生的信号转导至细胞内。

研究者曾使用脊髓匀浆或髓鞘提取物免疫动物来治疗脊髓损伤(SpinalCord Injury，SCI)，结果表明，免疫后的机体可通过产生抗抑制分子的抗体来封闭其抑制作用，由此促进动物损伤脊髓的功能恢复。但是，脊髓匀浆或髓鞘提取物中的成分相当复杂，除了含有上述三种抑制分子外，还包括许多其它成分。用它们来免疫动物，有诱发自身免疫病的危险，较理想的方案是使用几个抑制分子或用它们的受体作为免疫原。Sicotte等用联合使用重组的Nogo-66和MAG分子的片段作为免疫原免疫动物后，发现能够促进脊髓损伤后轴突的再生。也有实验室将几个抑制分子的基因片段串联至一个重组质粒中构建成DNA疫苗，发现也能在一定程度上促进脊髓损伤后的功能恢复。但是，用其受体NgR作为免疫原，目前还未见报道。

发明内容

本发明中制备抗人Nogo-66受体蛋白疫苗的方法如下所述。

从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因(不包含信号肽)。所用引物如下：

上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；

下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；

其中上游引物含BamHI位点，下游引物含HindIII位点和终止密码子。将扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6个His标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR。经酶切及测序鉴定正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达，并通过SDS-PAGE和Western Blot对表达的目的蛋白进行鉴定。最后，采用Ni-NTA亲合纯化系统(申能博彩公司)纯化出目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析鉴定。

重组质粒pET28-hNgR的双酶切鉴定(BamH I和HindIII)和PCR鉴定结果均显示，插入片断与预先设计一致(图1A)，DNA测序则进一步证明插入位点及序列完全正确。随后，重组质粒pET28-hNgR转化至大肠杆菌诱导表达，SDS-PAGE结果显示，经IPTG诱导后，该质粒可在大肠杆菌种表达一分子量为50KD左右的蛋白，与目的蛋白的预期分子量一致；用抗His标签的抗体进行Westen Blot鉴定，则进一步证明该条带即为带有6×His标签的hNgR融合蛋白。最终通过Ni-NTA亲和纯化系统纯化，成功获得了免疫动物所需的且纯度较高的hNgR蛋白(图1B，图1C)。本发明中抗人NgR蛋白疫苗可以在制备治疗或预防脊髓损伤的药中加以应用，也可以在制备治疗或预防肢体瘫痪的药中加以应用。

本发明所公开的抗NgR蛋白疫苗可以通过封闭NgR，阻断抑制因子的作用，从而促进脊髓损伤后神经元轴突的再生，减轻损伤区的组织坏死，促进损伤脊髓的功能恢复，其避免了外源性生物制剂，比较容易被自身免疫系统清除的缺点，另外也克服了针对NgR的DNA疫苗接种后主要诱发细胞免疫，只有少数个体能诱导出体液免疫的特点。

附图说明

图1A是重组表达质粒pET28a-hNgR的双酶切及PCR鉴定结果图，其中M1，M2：DNA分子参照标准，1：质粒pET28a-hNgR经BamH I和HindIII酶切后电泳图，2：质粒pET28a-hNgR的PCR电泳结果；

图1B是重组NgR蛋白的原核表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中1：未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，3：经纯化的重组NgR蛋白；

图1C是重组NgR蛋白的Western Blot鉴定结果图，其中1：未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白；

图2是ELISA法检测大鼠血清中的抗NgR抗体结果图；

图3是免疫组化检测进入损伤脊髓组织中的抗NgR抗体结果图；