[发明专利]多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因分型的方法，尤其涉及一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法。

背景技术

在生命科学及医学研究中，基因分型已经逐渐成为医学、遗传学和基因组学研究的热点问题之一。在理论研究方面，对于了解研究对象的遗传背景具有非常重要的作用，在临床方面，对于为具有不同遗传背景患者(或受检者)提供适当的诊断、治疗和预防措施也具有非常重要的意义。

基因分型的依据是已知的遗传标记——即基因中不同的突变位点。由于所用遗传标记的不同，应用的基因分型方法也不同。迄今已有多种基因分型的方法问世，如基因芯片法、ISSR、测序法等。

如何提供一种利用多元连接酶检测反应对已知序列的等位基因任何位点进行精确分型是科技技术人员要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供了一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，旨在解决上述的问题。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的：

根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物/探针”，每组至少包括：

引物1：含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型完全配对；

引物2：含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对或退火，并不与该待测位点的野生型配对；

1条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在5’末端带有磷酸基，同时在3’末端带有荧光标记的AMLR探针；

上述一组“多元核酸引物/探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子：

引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；

引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；

用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子会产生不同的结果：

由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应，形成连接产物；

由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火，与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反应，无法形成连接产物；

将反应体系进行热变性，只能得到引物1-AMLR探针的有效连接产物；

对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物1-AMLR探针的量即可供荧光检测或电泳检测。

对于突变型待测样本得到与上述相反的结果，即：形成引物2-AMLR探针连接产物；

对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会有三种检测结果：即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片段；

如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物的种类，无须改变AMLR探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：能够对已知序列的单基因的任意位点进行精确基因分型；能够同时对已知序列的多个基因的任意位点进行精确基因分型；可以用于基因的高通量分型检测，或常规的低通量实验室操作。

附图说明

图1是本发明原理示意图；

图2是两种等位形式的待测群体多元连接酶检测反应单基因精确分型结果示意图；

图3是多基因待测群体多元连接酶检测反应基因精确分型结果示意图；

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

由图1、图2可见：根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物/探针”，每组至少包括：

引物1：含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型(如：图1中碱基T)完全配对(如：图1中短引物)；

引物2：含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对(退火)，并不与该待测位点的野生型(如：图1中碱基T)配对(如：图1中长引物)；

1条能够与待测位点右端局部配对(退火)，并在5’末端带有磷酸基(图1中P)，同时在3’末端带有荧光标记(图1中FAM)的特定探针(如图1中AMLR探针)；

上述一组“多元核酸引物/探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子：