[发明专利]对核酸分子多片段基因进行平行检测和实时定量分析的方法

权利要求书

1. 一种平行测定样品中多个基因片段或是多个核酸区域的存在或量的方法，该 方法包括以下步骤：

a)提供样品液，所述样品液中包含待检测的基因片段或核酸区域；

b)提供固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种核酸探针分子；

c)提供至少一对一级引物，所述一级引物对中的至少一个引物包含与所述待测 核酸分子互补的区域和不互补的区域；

d)提供至少一对二级引物，所述二级引物对中的至少一个与所述一级引物对中 的所述至少一个引物的不互补区域的序列匹配；

e)使所述样品液、固相载体、一级引物、二级引物相互接触；

f)对所述样品中的待检测的基因片段或核酸区域进行扩增，在扩增反应时，用 荧光基团标记扩增产物；

g)使所述扩增产物在扩增反应中和所述核酸探针分子相互杂交；

h)激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子，检测此荧光信号的位置和强度， 从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探针分子通过化学键连接、 物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在载体表面。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应包括通过DNA 聚合酶、DNA反转录酶、RNA聚合酶、或是同时有多种这些酶参与的复制待测核酸 分子片段的反应。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级引物每种的浓度是1pM- 10nM，更优的是0.1-1nM。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个基因片段或多个核酸区域 是同一基因的不同突变形式。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤f)中，通过使用有荧光 基团标记的脱氧核苷三磷酸、有荧光基团标记的引物或其组合使扩增产物被荧光基团 标记。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激发杂交上的扩增产物上的荧 光基团的方法包括通过倏逝场来激发，所述倏逝场通过在所述固相载体内发生的光的 全内反射，或者通过平面波导来产生。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激发所述杂交上的扩增产物上 的荧光分子的方法包括通过荧光共振能量转换激发。

9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光共振能量转换激发为所述 扩增产物的荧光分子被连接在所述载体表面上的荧光基团的发射光所激发，或所述荧 光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分子的发射光激发连接在所述载体表面 上的荧光基团。

10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级引物对中的至少一个引物 中的不互补的区域包含标签序列。