[发明专利]光高粱的检测引物及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于农业植物检验检疫技术领域，具体地涉及一种利用分子生物学检测技术快速准确地检测光高粱的检测方法以及用于该方法的检测引物，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等领域使用。

(二)背景技术

光高粱(Sorghum.nitidum(Vahl)Pers)是世界十大恶性杂草假高粱的近似种，光高粱最早发现于印度西部，后传播到东南亚、印度尼西亚、澳大利亚等国。光高粱为多年生，且产生根茎，其形态和染色体大小与假高粱相似。Y.Sun等(1994)曾认为光高粱应归入Sorghum区组，而DeWet(1978)，Guo(1996)等则建议将其并入Parasorghum中，近似种的存在为口岸检疫准确快速鉴定假高粱增加了困难。

实际工作中，农产品中夹杂的假高粱等杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨损与变型，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差异，更为形态鉴定增加了难度，而细胞生物学方法等不仅需要较长的周期，而且仅依据染色体的形态仍难以鉴定。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的在于克服上述现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法存在的困难，提出采用分子生物学方法，针对核糖体序列设计光高粱的特异性引物，建立光高粱PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定的目的。

技术方案

目前，未见有光高粱的PCR方法鉴定报道，本引物是针对光高粱的rDNA的内转录间隔区序列设计的。18S～26S核核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区ITS被5.8S分为ITS1和ITS2两部分。ITS区在植物核基因组中是高度重复的。全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemrepeats)方式出现在一个或多个染色体基因位点上(Regers & Bendich 1987，综述见Hamby & Zimmer1992)。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如属间、种间)解决植物系统发育问题。屈良鹄和陈月琴(1999)通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出：被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2％～10.2％，属间差异值为9.6％～28.8％，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。

本发明的重点是用于检测光高粱的引物N3/N5以及所述的引物序列的完全互补链。针对光高粱ITS序列的特异性位点差异，设计了检测光高粱引物N3/N5，建立了光高粱种子的PCR检测技术。

光高粱PCR的检测方法，包括。

检测过程如下：

1种子DNA获取

单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取：

1)液氮中碾种子于1.5mL离心管中，加入500μL TES，TES由100mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA，2％SDS组成；

2)加7μL蛋白酶K混匀，置于55℃水浴60～120min，期间混匀几次；

3)调节盐浓度至1.4M，加1/10体积的10％十六烷三甲基溴化铵，置于65℃水浴10min；

4)加入等体积的SEVGA混匀，SEVGA为氯仿∶异戊醇＝24∶1，不能太剧烈，以保证DNA的完整性，0℃孵育30min；

5)4℃13,000r/min离心10min，取上清夜至1.5mL离心管中；

6)加225μL 5M醋酸铵混匀，0℃孵育30min以上，4℃13,000r/min离心2min；

7)取上清，加入3μL核糖核酸酶A，37℃水浴30min，以去除RNA；

8)加0.55体积的预冷异丙醇，-20℃放置30min以上；

9)4℃13,000r/min离心15～20min，弃异丙醇，70％乙醇洗2次。室温干燥，50μLTE或双蒸水溶解，TE为10mM Tris，1mM EDTA(pH8.0)。

2PCR扩增