[发明专利]适用于生产稳定性同位素15N标记L－亮氨酸的发酵生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于稳定性同位素标记化合物生产领域，涉及到微生物发酵生产工艺，尤其涉及适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺。

背景技术

¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸的生产可采用有机合成法、前体发酵法、酶法及提取法、直接发酵法等。采用合成法工艺繁琐，且需要光学拆分使¹⁵N原料利用率比较低，成本上升。水解法常用于制备复合氨基酸，要分开所有氨基酸很困难。酶法生产L-亮氨酸-¹⁵N需要α-氧代己酸、甲酸铵-¹⁵N作为原料，最终产量不是很高，原料甲酸铵-¹⁵N利用率较低。而采用直接发酵法生产，目标氨基酸大量富集，分离比较简单，但由于种子、发酵配方中有机氮源很难标记，常常使L-亮氨酸-¹⁵N的丰度下降很多达不到产品要求，筛选适用于L-亮氨酸-¹⁵N生产的工艺条件是该技术的关键。而且采用常规发酵方法，¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸产量虽然相对较高，但¹⁵N丰度下降很大，往往下降3％以上，很难达到高丰度产品要求。且由于要添加大量¹⁵N无机氮源，成本很高。采用全合成培养基发酵虽然对¹⁵N丰度影响不大，但产酸量太低使得¹⁵N原料利用率不高。目前，在¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸的生产领域中还不见专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足之处而提供一种¹⁵N-L-亮氨酸丰度高，¹⁵N利用率高的适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤：

(1)出发菌株的选取

选取适用于L-亮氨酸-¹⁵N生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌、谷氨酸棒杆菌；

(2)发酵培养配方

以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源，以葡萄糖为碳源，初始配方中葡萄糖浓度为6～14wt％；以氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等铵盐或尿素为初始氮源，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解液、菌体水解液等有机氮源的一种，该有机氮源中氨基氮浓度为5～20g/L；磷酸盐、镁盐、锰盐、亚铁盐等无机盐根据不同菌种添加一定量；发酵初始配方中生物素大大过量，VB1添加50～2000ug/L，VB6添加50～1000ug/L，泛酸添加50～500ug/L，尼克酸添加20～600ug/L；

(3)发酵工艺

根据产品需求量分别采用摇瓶发酵或发酵罐发酵工艺得发酵液；

所述的摇瓶发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，30℃下生化培养箱中培养16～30小时，待菌落长成后，将菌体接种于事先灭菌完的发酵培养液中，每瓶发酵培养液接一环菌体，发酵培养液的装液量为装液瓶的3wt％～5wt％，将接种完的发酵培养液置于摇摆式摇床上，发酵温度28～32℃，摇床转速180～240转/分钟，连续发酵72～96小时；

所述的发酵罐发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，30℃下生化培养箱中培养16～30小时，待菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在28～32℃下摇床培养10～24小时，获得种子液；发酵初始温度28～33℃，初始pH6.8～7.2，采用大接种量2～10wt％、低糖流加，强制控制发酵工艺，将种子按体积比2～10％接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制条件：温度29～37℃，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.01～0.05MP，溶解氧1～95％，PH7.0～7.5，采用添加液氨方式控制发酵液PH值，并以消泡剂消泡。

(4)分离提取

发酵液中¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸的分离采用离子交换法提取得到¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。