[发明专利]用于生物合成肝素酶的培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基，具体说，涉及一种以肝素黄杆菌Flavobacterium heparinum ATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基。

背景技术

肝素酶能特异性地断裂肝素和类肝素链上具有特定修饰的不同序列，产生不同的寡糖片段。肝素酶具有许多重要用途，包括体内循环中肝素的消除，肝素精确结构的确定，肝素抗凝机理和肝素结构与功能的研究，制备低分子量肝素及抗肿瘤药物等。国外报道采用肝素黄杆菌发酵生产肝素酶能够达到的1,475U/L的效价，而国内的报道也很低。其中，“肝素黄杆菌发酵产肝素酶的工艺优化”一文披露，可由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和玉米浆等作为培养基的有机氮源合成肝素酶但效果并不明显，其中采用如下培养配方((g/L)：葡萄糖8，氯化铵4，磷酸二氢盐6，组氨酸0.75，甲硫氨酸0.75，氯化镁0.5；微量盐10^-4mol/L)可将产酶量比原来提高66％。但现有技术中，由于肝素黄杆菌发酵生物合成肝素酶的效价普遍不高，成为了制约采用发酵法规模化生产肝素酶的主要障碍，是一个迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提高肝素黄杆菌发酵生物合成肝素酶的效价。

为此，本发明提供一种以肝素黄杆菌Flavobacterium heparinumATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨组成。

本发明的独特之处在于氮源的配方，即同时采用NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨。

所述NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的重量百分比为4∶4～5∶2～3，优选4∶4.6∶2.3。

所述NH₄Cl在培养基中浓度通常为2～5g/L，优选浓度为3～4g/L。

所述氨基酸为L-His和L-Met，当其浓度为0.25g/L到0.75g/L时，可以获得较好的生长和产酶效果，优选浓度为0.4g/L到0.6g/L。

所述肝素的浓度为1g/L到5g/L，优选2g/L到3g/L。

本发明所使用产生肝素酶的菌种为肝素黄杆菌，菌种编号为ATCC13125，实际用于生产的菌株可以为自主诱变获得的肝素酶高产菌株。

本发明的碳源可包括但不限于葡萄糖、半乳糖等，最优地使用葡萄糖，在培养液中该碳源浓度为1％～7g/L，优选浓度为3～5g/L。

本发明采用混合磷酸盐为磷酸钠盐或者磷酸钾盐，浓度为3～7g/L，优选为4～6g/L；本发明在培养液中添加微量元素(NaMoO₃，CuCl₂，FeCl₂，CoCl₂，MnCl₂，CaCl₂)，浓度为10^-3～10^-5M，最优为10^-4M。

本发明生物合成过程中的空气通气量通常在0.2～1.5vvm，优选在0.5～0.8vvm；温度控制在23～28℃，优选在24℃～26℃；可测得最高酶活力时间在30～36h，优选在32～34h。

本发明在发酵过程中pH值控制在6.0～7.0，优选为6.2～6.8。

发酵结束将细胞培养液离心(10,000r/min，8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。然后离心(14,000r/min，30min)收集上清即得无细胞粗酶。

采用本发明培养基配方培养肝素黄杆菌，菌体生长和产酶都优于文献所报道的培养基，菌体产量可达到15g/L(湿重)，产酶效价可高达2,000U/L。

具体实施方式

实施例1