[发明专利]油菜种皮颜色快速鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业应用生物技术领域，特别是涉及一种在油菜种子发育早期快速鉴定种皮颜色的方法。

背景技术

国内外大量研究表明，在相同遗传背景下，黄色种皮油菜(简称黄籽油菜)与黑色种皮油菜(黑籽油菜)相比具有种皮薄、含油量高、油中色素和杂质少、木质素含量低等优点(刘后利，2000；Rahman，2001；Somers，2001)。目前，黄籽油菜育种是目前油菜育种的热点。油菜种皮颜色要到成熟是才能显现出来。无论是黄籽还是黑籽在种子发育早期，种皮都是绿色的，育种者在种子发育早期不能对种皮颜色进行选择，需要在种子成熟后才能对种皮颜色性状进行选择，这样存在着费时、费工、费钱等问题。杂交油菜的应用也得到了广泛应用，在杂交油菜应用中，也有一个重要的问题，种子纯度的鉴定，现在生产上应用的方法，一般是异地繁殖，并从中进行鉴定杂种的纯度，费时费力，因此，找到一种快速鉴定种子种皮颜色的方法，可以在早期进行鉴定，油菜每株角果多，种子千粒重小，用种量也小，每鉴定一株，可以鉴定出的种子数量也多，这种方法对推进杂交油菜的推广有十分重要的意义。

在拟南芥中种皮颜色的突变与控制类黄酮(flavonoid)合成基因有关(Lepiniec，2006)。油菜与拟南芥同属十字花科，我们推测在芥菜型油菜中控制类黄酮合成的途径可能与拟南芥类似。我们在研究油菜黄黑籽形成的生物途径时，利用同源克隆方法，在芥菜型油菜克隆了类黄酮合成途径中的基因，然后以芥菜型油菜黄黑籽近等基因系授粉10天，20天的种皮为材料，利用类黄酮合成途径中的基因进行了差异表达分析(RT-PCR，Northern杂交)，发现黄黑籽种皮的类黄酮合成途径中二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR，Dihydroflavonol 4-reductase)表达有差异，DFR基因在黄籽种皮中不表达，我们推断导致黄黑籽差异可能是DFR基因所控制合成的物质(黄烷3，4-二醇等类似物)导致的，黄籽种皮中可能没有黄烷3，4-二醇。通过查找文献(Debeaujon，2000)，发现香草醛(Vanillin)在酸性条件下，能与黄烷3，4-二醇等类似物特异结合，由无色变为红色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直观、经济、简便的油菜种子发育早期快速鉴定种皮颜色的方法，以便应用于油菜的育种，并应用于杂交油菜种子纯度的鉴定，对于黄色种皮油菜的杂交种进行纯度鉴定。发明人从油菜种皮颜色形成的生物学等途径入手，深入研究了种皮颜色形成途径中的关键酶的作用机理、酶作用的产物及其相互关系，发现在油菜黄黑籽种皮发育过程中差异的物质是黄烷3，4-二醇及类似物(该物质是无色的)。本发明用化学染色法，加入使种子中黄烷3，4-二醇及类似物染色的化学物质，使种子中黄烷3，4-二醇及类似物染色，从而能简便、直观区分黄黑籽。所述的化学物质为香草醛(Vanillin)酸性溶液，其浓度一般为0.5％，通过该方法可以在油菜授粉后10天鉴定种皮颜色，从而达到对油菜种皮颜色性状进行早期选择的目的。

本发明提出的在油菜种子发育早期快速鉴定种皮颜色的方法，其步骤如下：

溶液配制：把0.5克香草醛加入100毫升5N HCl中，充分溶解。

取油菜授粉后10天的油菜种子，剥取种皮放在载玻片上，用上述溶液完全覆盖种皮，在常温下染色5分钟后观察种皮颜色。黑籽油菜的种皮由绿色染为红色，黄籽种皮不染色，仍然保持绿色。

本发明方法的优点是操作简单，分析速度快，使用试剂价格低廉。

具体实施方式

实施例1：

取授粉后10天的黑籽芥菜型油菜紫叶芥、平陆芥菜、涟水小菜籽、樟树辣菜和棱角6号的种皮放在载玻片上，用0.5％香草醛溶液完全覆盖种皮，在常温染色5分钟，种皮由绿色染为红色。

取授粉后10天的黄籽芥菜型油菜四川黄籽、内蒙大黄和努西纳的种皮放在载玻片上，用0.5％香草醛溶液完全覆盖种皮，在常温染色5分钟，种皮不染色，仍然为绿色。

实施例2：

四川黄籽与紫叶芥杂交获得F₁，F₁自交获得F₂，然后取F₂代植株(共160株)上授粉后10天种子的种皮放在载玻片上，用0.5％香草醛溶液完全覆盖种皮，在常温染色5分钟，并在种子成熟后观察种皮颜色(其中黑色种皮124株，黄色种皮36株)。结果表明在授粉10天后种皮染为红色的124株种子成熟后种皮全部为黑色，授粉后10天种皮未染上色的36株种子成熟后种皮全部为黄色。

实施例3：