[发明专利]一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法

权利要求书

1.一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获取原代培养的成人肺动脉平滑肌细胞：从获取的成人远端肺动脉平滑肌层中分离肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：

1>采用分次酶消化法，将分离并剥离了内外膜的血管中膜组织剪成小块，放入HBSS中4℃静置20～30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置10～20min；再将组织块放入离心管中加入消化液35～37℃消化35～45min；

2>吸出消化液，向离心管中加入完全培养基2～3ml，室温放置3～5min；广口巴氏吸管吹打10～15次，静置片刻使组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中，再将原消化液加入原离心管中进行再次消化并按以上步骤收集细胞；将收集的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入完全培养基调整细胞密度并以该密度种植于培养板中，置37℃、5％CO₂培养箱内静置培养，3d后半量更换培养基；当细胞生长至对数生长期，便获得了原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞；

所述的消化液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、5～15mol/L无水葡萄糖、2.0～3.0mg/mlI型胶原酶、9～10U/ml木瓜蛋白酶、1～3mg/ml牛血清白蛋白、0.5～1.51mmol/L1，4-二硫代苏糖醇、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5；

(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的胰蛋白酶溶液中含有0.1％乙二胺四乙酸，所述的细胞接种密度为2～3×10⁵个/ml。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2>中的细胞密度是2～3×10⁵个/ml。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1>的HBSS溶液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、15～25μmol/L氯化钙、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1>的无钙的HBSS溶液是：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2>中依据组织消化的情况，重复收集细胞操作2～4次。