[发明专利]蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明发明涉及一种微生物的检测方法，具体地说，涉及一种利用微生物的特异性酶对微生物进行快速检测鉴定的试剂盒及检测方法。

背景技术

“民以食为天”，食品食人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，尤其以沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌等引起的食源性疾病最为突出。据统计，发达国家每年约有1/3的人患食源性疾病，美国每年约有7600万例食原性疾病患者，食源性疾病已成为国内外普遍关心的问题。

蜡样芽孢杆菌是一种常见的食源性致病菌，自然界中分布甚广，常存在于食品、海产品、空气和水中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中通过不卫生的原料、用具和手污染。我国近两年食源性疾病监测网的资料显示，蜡样芽孢杆菌是仅次于致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌的又一重要致病菌。据调查，米饭、肉类制品、乳制品、蔬菜、水果的带菌率高达20％-77％。蜡样芽孢杆菌食物中毒在国外早有报道。近些年，我国各地也间有报道，并呈现上升趋势，中毒事件以在学校集体食堂、家庭、饮食服务单位等地发生居多。

目前认为蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒主要由该菌产生的肠毒素所致，其次是该菌感染，菌量和毒素量成正比。蜡样芽孢杆菌有产毒素和不产毒素两类，前者在适宜条件下会产生肠毒素，肠毒素又分为耐热性呕吐型和不耐热性腹泻型之分，前者主要在米饭类食品中形成，食后引起呕吐型肠胃炎，后者则在各种食物中均可产生，食后致腹泻型肠胃炎。我国引起食物中毒的食品大多与米饭或淀粉类制品有关，而在欧美一些国家大多由甜点心、肉饼、色拉等引起。呕吐型肠胃炎潜伏期一般仅数小时，症状有恶心、呕吐、头晕等，腹泻型肠胃炎一般发作在食后10-12小时，以腹痛、腹泻症状为主，偶有呕吐及发热。蜡样芽孢杆菌食物中毒有一定的季节性，以6-10月份居多，夏季最高，春秋次之。由于该菌污染食品后主要分解糖类，而食品没有明显的腐败变质现象，除有时稍有发粘、口味不爽外，感观基本正常，因此误食中毒的几率较大。

在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、AOAC、ISO、GB等标准对蜡样进行检测，包括甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，整个过程一般需要3-5天，且操作复杂，已不能满足微生物快速准确检测的现实需要，且在MYP平板上蜡样芽孢杆菌容易扩散影响计数，因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。

近年来，聚合酶链反应(PCR)、免疫学等方法的应用，使蜡样芽孢杆菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术也存在一定缺陷，比如技术要求较高，需要专业的技术人员进行操作，检测费用昂贵等。PCR方法需要先进行细菌富集，不能区分活菌和死菌，容易产生假阳性；免疫学方法还需要制备高纯度的抗体，因此这些技术很难满足企业和政府监管部门对大批食品样本检测需要。

发明内容

本发明的目的是针对以上不足，从生物化学的角度出发，提出一种利用蜡样芽孢杆菌特异性酶对其进行快速检测的试剂盒及检测方法。

本发明在分析蜡样芽孢杆菌特异性生化反应的基础上，筛选出细菌特异性酶，然后通过在分离培养基上加入细菌特异性酶的显色底物，研制出显色培养基，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴定，同时结合高效的样本前处理技术，由此开发出蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法，用于蜡样芽孢杆菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。

本发明的目的通过如下技术方案来实现：

所提出的蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒，包括有：

(1)显色培养基基础成分，其配方为：蛋白胨8-12g，胰蛋白胨4-6g，酵母粉7-9g，磷酸盐2.5-3.5g，丙酮酸钠9～11g，氯化镁0.8-1.2g，显色底物X-GLU 0.35～0.55g，琼脂11～13g，Na₂CO₃1～2g，pH7.0±0.2；

(2)培养基增补剂：Tween80；

(3)抗生素溶液：经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml，内含100,000IU的硫酸多粘菌素B；

(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。

使用上述的试剂盒进行蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测的方法如下：

(1)配制显色培养基：