[发明专利]结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中色素蛋白质材料领域，更具体地说，它涉及一种结合藻红胆素 (PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。

背景技术

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其 吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红 蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋 白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基 中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。 藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发 射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的 可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧 光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结 合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素 为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。

CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J，Cai Y A，Glazer A N.Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19)：10560～10565)。与 前人的方法不同，我们发现Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因编码beta裂合酶，在其 它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这类beta裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与CPC的beta 亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻蓝蛋白 类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸 巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白 质。藻红胆素PEB可由HO1、PebA、PebB协同催化生成(Alvey，R.M.，Karty，J.A.etc.Lesions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression.Plant Cell 15(10)，2448-2463(2003))。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存 在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合 成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC；隐藻中没有藻胆体， 不存在上述基因中的APC的基因。

藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻 胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723， 2002.04.17。一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)。本方法不利用 藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产新型的藻蓝蛋白。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优 良的荧光性质，这种结合PEB的新型藻蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选择。本 方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基 础。

发明内容