[发明专利]稻瘟菌激发子CSBⅠ基因及其克隆方法

权利要求书

1.一种稻瘟菌激发子CSB I基因，其特征在于所述基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID NO：1，氨基酸序列如SEQ IDNO：2。

2.权利要求1所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA；

(2)以(1)总RNA为模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一链；利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生理小种CSB I激发子的推导cDNA序列。

3.根据权利要求2所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(1)所述稻瘟病菌生理小种菌株为稻瘟病菌ZC13生理小种。

4.根据权利要求2所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(1)所述菌株培养为在培养基中25℃培养4天。

5.根据权利要求4所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于所述培养基为采用酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至1000mL，于121℃灭菌20min。

6.根据权利要求2所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(2)包括以下步骤：

(a)设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病菌ZC₁₃生理小种总RNA的3’RACE，得到CSB I基因cDNA的3’端的片段；

(b)在cDNA的3’端设计一特异引物P5B，并根据3’端序列与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白hypothetical protein MG07877.4的cDNA编码序列的5’端设计一特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5’端，得到CSB I基因cDNA的5’末端片段；

(c)3’和5’末端拼接得到序列；用3’端序列设计特异引物P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。

7.根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(a)所述引物分别为：

P33A：5’-GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3’；

P39A：5’-CARCARGCBTGGGTBATYCGTC-3’；

M13 Primer M4：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

8.根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(b)所述特异引物分别为：

P5B：5’-CTGCAAACACCCTCGAATGACCC-3’；

P5endA：5’-GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT-3’。

9.根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，其特征在于步骤(c)所述引物为：

P3endB：5’-GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA-3’。