[发明专利]诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分化，具体涉及一种诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。以往治疗糖尿病，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症；近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿病患者带来了新的希望，其中胚胎干细胞多向分化潜能最强，几乎可以分化为包括胰腺β细胞在内的所有成体组织细胞，但其面临着伦理学的争议，并且具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用；胰腺干细胞是最有潜能向β细胞分化的成体干细胞，但其难以分离、扩增并且具有较强的免疫原性。成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)容易进行体外分离、扩增和纯化，并且可取自患者自体，能解决细胞来源和免疫排斥问题，但其向胰腺β细胞分化的效率较低，分化细胞的胰岛素分泌量少而不稳定。

发明内容

为克服现有技术的上述缺点和不足，本发明提供一种诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。本发明所提供的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，包括以下步骤：

1、诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离、纯化及扩增人胎骨髓间充质干细胞：分离人胎骨髓间充质干细胞，然后收集细胞培养，当细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗后，用胰酶处理，然后加入完全培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，离心后弃上清，再用完全培养基重新悬浮细胞；然后传代培养；

(2)诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：用预诱导液抑制细胞增殖，待其达到90％融合时，常规消化，然后接种、诱导，诱导6～12天即得胰岛β样细胞团。

步骤(1)所述的用胰酶处理优选以下过程：加入质量浓度为0.25％胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入质量浓度为0.25％胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃消化1～5min。

步骤(1)所述的完全培养基优选含100mL/L  FCS、2mmol/L谷胺酰胺20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。

步骤(1)所述的传代培养优选如下过程：首次传代按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养。

步骤(2)所述的预诱导液优选含50mL/L FCS，2×10^-5mol/L LY294002，1×10^-2mol/L β-Me的DMEM/F12培养基。

步骤(2)所述接种、诱导优选如下过程：按1∶2比例接种于25cm²培养瓶中，每瓶加5mL诱导液诱导。所述诱导液优选含有10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF、1％-2％FCS的IMDM培养液。

本发明所述的人胎是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在体外将其初步诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞，胰岛β样细胞可进一步用于制备治疗糖尿病的药物。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，可带来较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为未诱导的MSCs形态图。

图2为诱导6天后所得的胰岛样细胞团形态图。

图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图4是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片；其中其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图6是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)。

图7是人胎肝间充质干细胞诱导前后超微结构的变化对比图(扫描电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。

图8是诱导后的人胎肝间充质干细胞超微结构图(透射电镜)；其中，图A为诱导后的超微结构图；图B为图A的放大。

图9是RT-PCR鉴定诱导后的胰岛样细胞团胰岛相关基因表达的电泳图。

图10是不同溶液对正常小鼠血糖值影响的曲线图。