[发明专利]华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR－RFLP鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的分子生物学方法，进一步涉及一种华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR-RFLP鉴别方法。

技术背景

牡蛎是国内外最主要的经济贝类之一，其肉味鲜美，素有“海中牛奶”之称，极具营养价值和经济价值。牡蛎养殖是贝类养殖产业中产量最大、分布最广的产业，牡蛎养殖的总产量和单位面积产量都在所有养殖品种中位居首位。在我国养殖的就有6-7种之多，华南沿海的巨蛎属牡蛎主要有太平洋牡蛎(C.gigas)、葡萄牙牡蛎(C.angulata)、香港巨牡蛎(C.hongkongensis)、有明巨牡蛎(C.ariakensis)、熊本牡蛎(C.sikamea)、C.iredalei和C.iredalei sp。然而，由于牡蛎的贝壳形态可塑性很强，极易受到所处的环境影响，单纯依靠贝壳的外部形态有时很难区分具体的种类，尤其对牡蛎幼体和稚贝更是如此；这对我国牡蛎资源的调查、研究和利用非常不利，同时，这也是一直困扰贝类分类学者的一个问题。分子生物学技术给这一问题提供了很好的解决办法，线粒体16S rDNA和COI序列在生物物种中非常保守，被广泛应用于物种的分类和进化研究。利用其在各个物种之间存在的序列核甘酸的不同，使用限制性内切酶对扩增的16S rDNA和COI序列酶切，可产生不同长度和数量的核甘酸片段，进行普通的琼脂糖凝集电泳即可分辨出不同种类。此方法在我国牡蛎种类的鉴定中还未见有公开报道，这将为华南沿海分布的巨蛎属种类的鉴定提供科学的方法，对牡蛎选择育种和养殖业的发展提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种对华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR-RFLP鉴别方法。它适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测快速，更准确，相比形态学方法可靠性高。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：首先利用大量测序的华南地区牡蛎种类的16S rDNA和COI序列，通过DNAstar中的MapDraw软件分析，选取适合的内切酶组合；随后，进行基因组DNA提取和目的片段的PCR扩增；最后利用选取的内切酶对PCR产物酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤如下：

(1)选取内切酶组合

对华南沿海巨牡蛎属种类，根据其已获得的16S rDNA和COI序列，通过ClustalW进行序列比对发现和检测不同种类间序列的差异，应用MapDraw软件分析，选出内切酶组合，其中对16S rDNA片段挑选出Dde I/Dra I和Alu I/Mse I两组双酶切组合，对COI序列片段挑选出Nis I/Alu I和Nis I/Dde I两组双酶切组合；

(2)基因组DNA提取

A.取闭壳肌组织0.1克，加入700ul抽提缓冲液中在37℃下消化过夜；

B.用等体积比例体积比25∶24∶1的酚-氯仿-异戊醇混合液，充分振荡混匀，12000g/分，离心10-15分钟；

C.取上清液，重复步骤B；

D.加入等体积的氯仿，混匀，12000g/分，离心5-10分钟；

E.取上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积3M的乙酸钠；

F.12000g/分，离心12-20分钟，去上清液，70％乙醇洗涤1-2次；

G.让乙醇彻底挥发，将基因组DNA沉淀溶于50ul无菌纯净水，即得基因组DNA，4℃保存备用；

(3)目的片段PCR扩增

PCR反应体系为50ul，包含5ul 10×buffer，0.6ul 2.5U/ul Taq酶，100ng基因组DNA，引物为0.2uM，dNTP为0.2mM，Mg²⁺为2mM；PCR反应条件为，先预变性94℃2分钟，而后进行94℃变性45秒，对COI 48℃或对16S 50℃复性1分钟和72℃1分钟，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，得扩增样品；扩增16S和COI基因片段两对通用的引物分别为：

16SarL/16SarH：5`-CGGTGTTTATCAAAAACAT-3`/5`-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3`；

COIL1/COIH：5`-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3`/5`-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA-3`；

(4)酶切反应