[发明专利]链亲和素－肿瘤坏死因子α融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及肿瘤坏死因子α的重组蛋白。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNFα)由细菌脂多糖等活化的单核-巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，具有如下功能：能直接杀灭肿瘤细胞而不损伤正常细胞；能增强巨噬细胞的活性和杀伤功能，增强巨噬细胞促进免疫应答的能力，发挥抗感染作用；能促进炎症局部的中性粒细胞的活性和聚集；能促进T淋巴细胞产生干扰素、IL-6等，增强机体抗病能力；能与IL-1、IL-2、干扰素等协同增强免疫力。但是，肿瘤坏死因子α血中浓度过高时，可引起休克、高热及肺、心脏和肾上腺损害，从而大大地限制了它的临床应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型肿瘤坏死因子α。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种融合蛋白，该蛋白主要由链亲和素、接头肽和肿瘤坏死因子α连接构成，其中链亲和素连接在接头肽的N端，肿瘤坏死因子α连接在接头肽的C端；所述的接头肽为Ser Ser GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、肿瘤坏死因子α基因以及连接所述的链亲和素和肿瘤坏死因子α的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，如组氨酸标签等。

本发明所述的融合蛋白，其氨基酸序列可以是SEQ NO.1或SEQ NO.2。

本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的融合基因，该融合基因由成熟链亲和素cDNA、肿瘤坏死因子αcDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGGGGC GGA TCC连接而成；该多核苷酸的成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CAT CATCAC CATCAC CAT。

将所述的编码本发明融合蛋白的融合基因通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得能表达本发明融合蛋白的工程菌。

本发明还提供一种高效表达本发明融合蛋白的工程菌，该工程菌是转化了本发明融合基因的pET24重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，其制备方法是：将本发明融合基因克隆于带有T7启动子的表达载体pET24中，构建成含有本发明融合基因的表达质粒，  转化大肠杆菌BL21(DE3)后实现了高效表达，本发明融合蛋白在菌体中以包涵体的形式存在，表达量高达30～40％；从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。

本发明融合蛋白同时具有链亲和素和肿瘤坏死因子α的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将肿瘤坏死因子α锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持肿瘤坏死因子α的活性；但如果将本发明融合蛋白中的链亲和素连接在接头肽的C端，则所得的融合蛋白没有肿瘤坏死因子α的活性。

经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。

本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将肿瘤坏死因子α迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使肿瘤坏死因子α在局部达到持续有效的治疗浓度，以至不会引起全身的毒副反应。此外，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤细胞的量是可以精确控制的。

附图说明

图1是6His-SA-L-TNFα-pET24重组质粒的结构图。

图2是6His-SA-L-TNFα的SDS-PAGE电泳图，其中1是蛋白质分子量标准，2是未诱导全菌，3是诱导后全菌，4是包涵体，5和6是纯化的融合蛋白。

图3是用抗TNFα单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发明融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰的细胞(阴性对照)，而右峰为锚定修饰的细胞。